Свечение супроводжує біологічні реакции

ДОКЛАД.

Енергійно які відбуваються хімічні реакції супроводжуються, зазвичай, виділенням енергії у вигляді тепла; існують, але такі реакції, які супроводжуються випромінюванням світла. Світіння, супроводжує хімічні реакції, називається хемилюминесценцией (ХЛ).

Хемилюминесценция (ХЛ) — світіння, супроводжує хімічні реакції. Вона зокрема у тому випадку, тоді як реакції відбувається виділення великого кількості енергії, наприклад, у реакції взаємодії двох радикалів чи реакціях з участю перекисів. Останнім часом дедалі більше інтерес приваблює власне («сверхслабое ») світіння клітин та тканин тварин і звинувачують людини, що обумовлено реакціями вільних радикалів: радикалів ліпідів і кисню, і навіть окису азоту, — сполуками, граючими величезну роль життя організму, а за певних умов — та розвитку низки патологічних состояний.

Молекулярний механізм хемилюминесценции.

Нині відомо значна частина хімічних реакцій, що супроводжуються світінням. Найчастіше — це досить складні процеси з багатьма проміжними стадіями. Але кілька простих випадків, у яких механізм перетворення енергії хімічної реакції друком цілком понятен.

Одне з них світіння, бачимо при взаємодії органічних радикалів, одержуваних електрохімічним шляхом. У розчин люминесцирующего органічного речовини (в дослідах брали поліциклічні вуглеводні) в органічному электролите (проводяться електрику) опускали пару електродів, з допомогою яких через розчин пропускали електричний ток.

Рис. 2. Хемилюминесценция при рекомбінації катіон — і анион-радикалов полициклических вуглеводнів. 1 — Між електродами, опущеними в розчин органічного електроліту, докладають різницю потенціалів. З катода електрони захоплюють молекулами й утворяться анион-радикалы. На аноді електрони відриваються від молекул й утворяться катион-радикалы.2 — 5 — При взаємодії катион-радикала і анион-радикала внаслідок їх зіткнення (2) електрон переходить з катион-радикала на анион-радикал (3). Однак цьому є можливість те, що буде не так на найнижчому електронному рівні, але в вищому. Утворюється збуджена молекула вуглеводнів (червоний гурток на схемою 4). При переході електрона більш низький рівень відбувається высвечивание кванта світла (5). Схема електронних рівнів в радикалів і молекулах продуктів реакції дана на рис. 3.

З катода (-) на молекули люминесцирующего речовини (позначимо їх як НА) переходять електрони й утворяться анион-радикалы (заряджені негативно). На аноді (+) електрони віднімаються від молекул й утворяться катион-радикалы (заряджені позитивно, див. рис. 2, вгорі). Якщо тепер розчин перемішати, катион-радикалы взаємодіятимуть з аніонрадикалами (рис. 2, внизу); у своїй утворюється дві молекули вихідного вуглеводнів, одній із яких може у электронно-возбужденном стані перебуває й перетворюється на основне стан із испусканием кванта світла (фотона).

На рис. 3 показані верхні електронні енергетичні рівні в реагують радикалів і продуктах їх взаємодії. У молекулах на верхньому заповненому електронному рівні електрони розташовані попарно (рис. 3, 1). У катион-радикала на верхньому рівні залишається тільки один, неспаренный електрон. У аніон радикала з’являється неспаренный електрон ось на чому (розташованому вище) енергетичному рівні (рис. 3, 2).

Рис. 3. Схема електронних енергетичних рівнів учасників реакції взаємодії катион-радикала і анион-радикала однієї й тієї ж вещества.

1 — вихідна молекула; 2 — анион-радикал; 3 — катион-радикал; 4 — перенесення електрона з анион-радикала на катион-радикал; 5 — перенесення електрона в электронно-возбужденной молекулі продукту реакції, який супроводжується висвічуванням кванта світла хемилюминесценции.

При взаємодії радикалів (мають протилежний заряд і тому притягивающихся друг до друга) статися перенесення електрона може відбутися в такий спосіб, що дві електрона виявляться різних рівнях (рис. 3, 4). Останнє означає, що з її зовнішніх електронів не на найнижчому вільному електронному рівні, як в вихідних молекул, але в вышележащем електронному рівні. Така молекула під час переходу в основне стан випускає квант світла (рис. 3, 5). Ми, що все процес можна розділити втричі стадии:

1. Відновлення однієї з учасників реакції (приєднання електрона) і окислювання другого (відрив електрона). Це спричиняє запасанию хімічної енергії у системі, яка згодом виділиться як фотона.

2. Перенесення електрона (окислительно-восстановительная реакція) не так на найнижчий, але в одне із вищих енергетичних рівнів й освіту в такий спосіб продукту реакції в электронно-возбужденном состоянии.

3. Высвечивание фотона під час переходу молекули з электронно-возбужденного в основне стан (люмінесценція). Зазвичай хімічні реакції, що супроводжуються світінням, протікають через низку проміжних стадій, але основні етапи запасания і высвечивания енергії загалом подібні .

Вітчизняний учений А. Р. Гурвіч був охарактеризований першим, хто зазначив існування власного слабкого світіння клітин тварин і звинувачують рослин, названого їм «митогенетическими променями ». Відповідно до А. Р. Гурвичу, мітогенетичні промені - це надзвичайно слабке ультрафіолетове випромінювання клітин, яке індукує розподіл оточуючих клітин. Хоча саме А. Р. Гурвіч використовував щоб виявити променів лише «біологічний детектор », т. е. різні діляться клітини, його послідовники у Росії (З. Родіонов і Р. М. Франк, 1934 р.) за кордоном (R. Aubert, 1938 та інші) розробили фізичний детектор випромінювання: газорозрядний лічильник фотонів з кварцовим вікном, прозорим для УФ-лучей.

У настояще час слабке світіння вдається вивчати лише з розчинах чи суспензіях клітин, а й у цілих органах у складі організму наприклад, печінки чи легкого.

У такий спосіб засвідчили, що власний світіння тканин може бути відповідальні три типу реакций:

1) Реакції про активних форм кислорода.

2) Реакції ланцюгового (перекисного) окислення липидов.

3) Реакції з участю окису азота.

Останнім часом дедалі більше інтерес приваблює власне («сверхслабое ») світіння клітин та тканин тварин і людини, яке зумовлено реакціями вільних радикалів: радикалів ліпідів і кисню, а також окису азоту, — сполуками, граючими величезну роль життя організму, а за певних умов — та розвитку низки патологічних состояний.

Чому він «сверхслабое », це світіння клітин та тканей?

Чим пояснюється низька інтенсивність хемилюминесценции, супроводжує реакції вільних радикалов?

Причин цілих трьох. По-перше, сама концентрація радикалів в біологічних системах дуже мала через їхньою високою хімічної активності, тому малі й швидкості реакцій, що супроводжуються світінням. По-друге, не всяке хімічне взаємодія радикалів неодмінно призводить до освіті электронно-возбужденных молекул продуктів реакції, як і зображено на рис. 3 (4). Навпаки, в переважну більшість окислительновідбудовних взаємодій між молекулами чи радикалами електрон переноситься не так на рівень порушеної стану, я на нижній вільний рівень, і наступного высвечивания кванта немає. У третіх, навіть як і утворилася збуджена молекула продукту, можливість, що висвітиться квант, а чи не станеться розтрати енергії в тепло, теж зазвичай дуже мала.

Дві останні причини призводять до того, що квантовий вихід хемилюминесценции у разі, скажімо, реакції двох перекисных радикалів не перевищує 10−8-10−10. Це тому, що квантовий вихід освіти порушених молекул продукта равен всього 10−4-10−5, а квантовий вихід люмінесценції продукта составляет для кетонов, які виникають при взаємодії перекисных радикалів, своєю чергою, теж близько 10−4- 10 — 5.

Ось і виходить, що спільна квантовий вихід хемилюминесценции становить лише 10−8-10−10.

Застосування власної (неактивованої) хемилюминесценции.

Майже по тому, як з’явилися перші роботи з власної хемилюминесценции клітин та тканин, спробували використовувати цей показник у цілях клінічної діагностики. По зрозумілих причин першими об'єктами були цілісна кров, і плазма крові хворих людей. Оскільки власне світіння було досить слабким і вимірювати його було важко, було зроблено багато спроб посилити це світіння: до плазмі крові додавали барвники, перекис водню, іони двухвалентного заліза тощо. [4]. Природа хімічних реакцій, що обумовлюють світіння, була зрозуміла які завжди, але авторів пропозицій це занадто турбувало: аби була відмінність між хворими і здоровими, та ще краще між готували різні групи хворих. Швидше дивовижно, що з ряді патологій різниця було досить істотною. Мабуть, найбільше публікацій у літературі присвячено світінню плазми крові, до котрої я для ініціювання ланцюгового окислення ліпідів додавали солі двухвалентного заліза. Амплітуда сигналу хемилюминесценции добре корелювала з кількістю продуктів перекисного окислення ліпідів, визначених хімічним методом, і від ліпідного складу плазми крові й концентрації у ній антиоксидантів, тобто речовин, гальмують процеси, які йдуть із участю вільних радикалів. В багатьох випадках дані таких аналізів було визнано цінними як додаткові за нормальної постановки лікарем діагнозу захворювання, контролю над ефективністю лікування та профілактики прогнозу течії хвороби. І все-таки вимір неактивованої хемилюминесценции у клінічну практику доки увійшло на відміну від хемилюминесценции у присутності активаторов.

У присутності певних сполук, зазвичай названих у вітчизняної літературі «активаторами », світіння клітин та тканин може посилитися кілька порядків величини. Найбільшого поширення набула одержало вимір хемилюминесценции, що з виділенням клітинами активних форм кисню (до яких належать супероксид, гидроксильный радикал, перекис водню і гіпохлорит): хемилюминесценция зокрема у присутності активаторів люминола і люцигенина. Активована хемилюминесценция доволі застосовується у клінічному біохімічному анализе.

Активована хемилюминесценция.

Власна хемилюминесценция, що супроводжує біохімічні реакції в клітках і тканинах, має, зазвичай, дуже низької інтенсивністю і випадком отримала назва «сверхслабого світіння ». Це виявилося головним і що не перебореним перешкодою шляху до широкого використання власної хемилюминесценции в аналітичних целях.

Значне поширення одержало проте вимір хемилюминесценции у присутності певних сполук, які отримали вітчизняної літературі під назвою «активаторів », а й за кордоном — «підсилювачів «(enhancer) хемилюминесценции. По механізму дії активатори розпадаються на дві чітко різняться групи, які можна відповідно назвати хімічними і фізичними активаторами .

Хімічні активатори ХЛ — це сполуки, котрі вступають у реакції з активними формами кисню чи органічними вільними радикалами, під час яких утворюються молекули продуктів в порушену електронному состоянии.

Бачимо у своїй hemilum пов’язані з переходом молекул в основне стан., що зумовлює высвечиванию фотонов:

Активатор + радикали > продукт* > продукт + фотон.

Добре відомими представниками таких активаторів можуть бути люминол (3-аминофталевый гидразид, див. Рис. 4) і люцигенин [Бис (Nметилакридиний)] Фізичні активатори не входять у хімічні реакції і не впливають перебіг реакцій, що супроводжуються hemilumм, але з тих щонайменше багаторазово посилюють інтенсивність хемилюминесценции. У основі їхніх дії лежить фізичний процес процесу перенесення (міграції) енергії з молекули продукту хемилюминесцентной реакцію активатор:

Радикали > продукт* > продукт + фотон 1 (неактивированная ХЛ) Продукт* + активатор > продукт + активатор* > фотон 2 (активована ХЛ).

Хемилюминесцентный імунний анализ.

По ідеології хемилюминесцентный імунний аналіз не відрізняється від радиоиммунного, із тією лише різницею, що замість радиоактивно-меченных субстратів чи антитіл використовуються субстрати і антитіла, «мічені «з'єднанням, яке входить у реакції, що супроводжуються хемилюминесценцией, у присутності перекису водню і каталізатора (зазвичай це фермент пероксидаза).

Хемилюминесцентной міткою (ХЛ-меткой) найчастіше служать низькомолекулярні сполуки, з хімічного структурі близькі люминолу і люцигенину, такі як изолюминол, сукцинилированный люминол, ефіри акридиния та інші. Приєднання хемилюминесцентной мітки виробляється або до антигену, т. е. низкомолекулярному з'єднанню або до антителу на цей антиген. У першому випадку метод називається CIA (Chemiluminescent Immuno Assay), у другому — ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По русски це відповідала б ХИА (Хемилюминесцентный Імунний Аналіз) і ИХМА (ИммуноХемилюминоМетрический Анализ).

Обидва методу спрямовані визначення биологически-важных низькомолекулярних сполук (наприклад, гормонів) у його концентраціях (як правило, низьких), у яких зустрічаються в біологічних объектах.

З використанням методу CIA до розчину, який містить цікавить нас аналізоване з'єднання (позначимо його як A) додають певне кількість того-жі, але ХЛ-меченного сполуки (позначимо його як A*) і антитіла (анти-A). Утворюється суміш мічених і немеченных імунних комплексів (A-анти-A і A*-анти-A, соответственно):

A + A* + анти-A > A-анти-A + A*-анти-A.

Дуже важливо було, що пропорція між міченим і немеченым імунними комплексами залежить від цього, скільки меченного антигену ми додали (A*) і скільки немеченого був у досліджуваної пробі (A), саме: чим було немеченого антигену, тим менше частка мічених антител.

Тепер залишається очистити суміш імунних комплексів і побачити кількість A*-анти-A по хемилюминесценции. Інтенсивність ХЛ тим менше, чим було немеченых антигену A (т. е. аналізованого речовини) в досліджуваної пробі. Щоб аналіз був кількісним, попередньо будують калибровочную криву, т. е. вимірюють залежність інтенсивності ХЛ в кінцевої пробі від концентрації стандартного розчину досліджуваного речовини A. Потім вимірюють інтенсивність ХЛ в розчині з невідомої концентрацією антигену (A), повторюючи самі процедури, і з каліброваної кривою знаходять концентрацію A.

З використанням методу ICMA беруть надлишок ХЛ-меченного антитіла (антиA*) і додають щодо нього розчин з досліджуваним речовиною (A). Утворюється ХЛмічений імунний комплекс:

A + анти-A* > A-анти-A*.

Залишається відокремити імунні комплекси з інших учасників реакції і виміряти інтенсивність ХЛ. У разі вона тим більша, що більше було аналізованого речовини A в пробі. Для кількісного аналізу та тут попередньо будують калибровочную кривую.

У обох методах одне з практичних труднощів — це очищення імунних комплексів. Воно вирішується також методами імунохімії. Деталі цієї техніки ми тут розглядати думати, але одне із підходів полягає, наприклад, в використанні порошку сорбенту (див. Рис. 6 У), до якого «пришиті «(т. е. приєднано ковалентної хімічної зв’язком) антитіла до анти-А (назвемо їх анти-анти-А). У присутності розчинених комплексів (Аанти-А і/або А*-анти-А) утворюється потрійний комплекс («сандвіч »): (анти-антиА)-(анти-А)-А і/або (анти-анти-А)-(анти-А)-А*. Адсорбент можна осадити і потім накинути у осаді (після додаткових обробок) кількість меченного антигена.

Биолюминесценция.

Біолюмінесценція — (БЛ) — це hemilum живих організмів, видиме простим оком. Спроможність до БЛ мають організми, належать до різним систематичним групам: бактеріям, грибам, молюскам, комахою. Механізм реакцій, що супроводжуються hemilumм, дуже різний в різних видів; проте зазвичай включає у собі хімічне перетворення певного низкомолекулярного субстрату, званого люциферином, катализируемое ферментом, званим люциферазой.

З розвитком техніки виміру дуже слабких світлових потоків стало ясно, що світіння при хімічних реакціях (хемилюминесценция) — не така вже екзотика. Слабка світіння супроводжує сутнісно все хімічні реакції, які йдуть із участю вільних радикалів. Власне світіння тварин клітин та тканин зумовлено переважно реакціями ланцюгового окислення ліпідів і реакціями, що супроводжують взаємодія окису азоту NO та супероксидного радикала.

Відому віддавна видиме простим оком світіння деяких організмів, наприклад світляка, яку називають биолюминесценцией, також знайшло широке використання у клінічних аналізах і медико-біологічних наукових исследованиях.

Біолюмінесценція светляка.

Усім відоме hemilum світлячків відбувається внаслідок біохімічної реакції окислення светлячкового люциферина киснем повітря на присутності аденозинтрифосфорної кислоти (ATP): |E + LH2 + ATP > E-LH2-AMP + PP | |E-LH2-AMP P*-E-AMP > E + P + AMP + фотон |.

Тут AMP — аденозинмонофосфат, PP — пірофосфат, E — люцифераза, LH2 — люциферин, P* і P — продукт реакції (оксилюциферин) в порушену і основному станах, соответственно.

За відсутності АТФ біолюмінесценція немає; у цьому грунтується один із найчутливіших методів аналізу АТФ у різних об'єктах. Для визначення змісту АТФ дивляться хемилюминесценцию в досліджуваному розчині, якого додають суміш люциферина і люциферазы, виділених з світлячків або отриманих синтетично і методом генної инженерии.

Вдається визначати зміст АТФ в зразку від 10−17 моля і выше.

Оскільки біосинтез АТФ — показник нормальної життєдіяльності клітин, препарат люциферин — люцифераза світляка використовують із виявлення бактеріального зараження у будь-якій середовищі, оцінки життєздатності еритроцитів при консервуванні крові, вивчення дії на мікроорганізми антибіотиків тощо Останнім часом використовують препарати иммобилизованной люциферазы (т. е. ферменту, молекули якого хімічно пов’язані з полімерної плівкою), стабільність якої вище; такий препарат можна використовувати многократно.

Біолюмінесценція світних бактерий.

До світних належить трохи видів бактерій. Хемилюминесцентная реакція, безпосередньо супроводжувана hemilumм, каталізується ферментом — бактеріальної люциферазой і включає у собі процеси окислення відновленого флавинмононуклеотида ФМН-Н2 до ФМН і водночас — алифатического (С14) альдегіду до миристиновой (С14) кислоти Останні роки одержують всі популярнішими біохімічні аналізи, у яких як тест-объекта використовують цілі бактеріальні клітини (в суспензії), екстракти світних бактерій, ізольований фермент — люциферазу.

Насамперед, вимір біолюмінесценції бактерій можна використовуватиме визначення низьких концентрацій кисню. Річ у тім, що за відсутності кисню фотобактерии що немає hemilumм, hemilum посилюється пропорційно концентрації кисню серед в інтервалі концентрацій О2 від 2•10−8 до 5•10−6 моль/л.

Можна також використовувати світні бактерії і як «лабораторного тваринного », т. е. живих організмів, у яких вивчають, приміром, дію різних токсичних речовин. Світні бактерії дуже чутливі до домішкам токсичних речовин, у воді, і вимір біолюмінесценції можна використовуватиме оцінки забруднення води токсичними сполуками, скажімо іонами важких металлов.

З іншого боку, hemilum бактерій можна використовуватиме попередньої оцінки ефективності нових антибіотиків. Але найбільше перспективне, безсумнівно, застосування очищених препаратів бактеріальної люциферазы. Фермент, очищений від домішок низькомолекулярних сполук, може до випромінюванню світла лише у присутності всіх трьох субстратів: кисню, ФМН-Н2 і длинноцепочечного альдегіду (із довжиною ланцюга щонайменше 8 вуглецевих атомів). Додавши до ізольованій бактеріальної люциферазе ФМН-Н2, дослідник отримує высокочувствительную систему для визначення алифатических альдегідів; до числа належать, зокрема, статеві гормони комах, феромоны, знайдених у кількості 10- 14 міль, що дозволяє вивчати метаболізм цих речовин в однієї особи.

Біолюмінесценція медузи Aequorea.

Останнім часом щоб виявити малих кількостей іонів кальцію широко використовується хемилюминесценция білка, виділеного з медузи Aequorea. Цей фотопротеин, званий акворином, містить у собі ковалентно пов’язаний люциферин, який у присутності іонів Са2+ піддається хімічним перетворенням із заснуванням продукту порушену електронному стані. У результаті малої інерційності і високої чутливості биолюминесцентный метод дуже ефективний щодо вивільнення і зв’язування Са2+ в біологічних системах, наприклад, під час м’язового скорочення. У цьому экворин додають безпосередньо до досліджуваному об'єкту і з інтенсивності біолюмінесценції опікуються динамікою зміни змісту вільного кальция.

Заключение

.

Подібно багатьох інших розділах науки, хемилюминесценция і біолюмінесценція спочатку були об'єктом дослідження, і потім стали методом дослідження інших об'єктів. Сьогодні хімічні і навіть фізичні явища, які у основі чудесного перетворення енергії біохімічних реакцій в світлове випромінювання, переважно расшифрованы.

Почалося більш-менш широке використання хемиі біолюмінесценції в біохімічних лабораторних і зникненню клінічних дослідженнях. Створюються серійні прилади — хемилюминометры і биолюминометры, випускаються набори реактивів для аналізу певних антигенів, антитіл і ферментів в крові з онкозахворюваннями та за іншими біологічних рідинах. Ведеться пошуку нових сполук, спроможних розпочинати хімічні реакції, що супроводжуються hemilumм, з химически-активными продуктами життєдіяльності живих клітин, такі як вільні радикали і пероксиди (хімічні активатори ХЛ), як і речовин, посилюючих квантовий вихід хемилюминесценции (фізичні активатори ХЛ).

Водночас розширюється використання у аналітичних цілей методів біолюмінесценції. Прогрес органічної хімії, молекулярної біології і біотехнології позбавив нас від виробничої необхідності подорожувати на південь, щоб ловити ночами світляків, чи полювати в океані за медузами, щоб виділення з живих істот фермент люциферазу і субстрат биолюминесцентных реакцій — люциферин: люциферины навчилися синтезувати, а багато люциферазы можна отримати роботу зараз методами генної інженерії. Інакше кажучи, застосування методів хемиі біолюмінесценції безумовно допоможе пролити світло на багато загадок, ще вирішені учеными.