Виробництво глютамінової кислоти

Реферат бактерія глютаміновий кислота Дана курсова робота виконана згідно отриманого завдання. Структура курсової роботи відповідає вимогам щодо порядку оформлення курсових робіт, вказаних в «Методичних вказівках до виконання курсової роботи» (номер 6501).

Зміст даної курсової роботи викладений на 29 сторінках. Курсова робота містить 2 схеми, 2 таблицi, 3 графіки, 9 літературних джерел.

У загальній частині курсової роботи представлена характеристика бактерії, Corynebacterium glutamicum, що використовується для виробництва глютамінової кислоти.

У розрахунково-графічній частині містяться розв’язки розрахунково-графічних завдань курсової роботи.

У розділі «Визначення показників швидкості росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів» розраховані показники росту мікроорганізмів при періодичному культивуванні.

У розділі «Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів» проаналізовано склад поживного середовища і придатність його для вирощування мікроорганізмів, розраховано теоретично можливий рівень біомаси за кількістю азоту і вуглецю, що містяться у поживному середовищі.

У розділі «Енергетичний баланс окислення субстрату» проведено аналіз енергетичного балансу окислення глюкози за заданих умов.

Ключові слова: Corynebacterium glutamicu, експоненційний ріст, біомаса, лаг-фаза, поживні середовища, цикл трикарбонових кислот

ЗМІСТ

ВСТУП

ЗАГАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 1. Обґрунтування вибору біологічного агента

Розділ 2. Характеристика біологічного агента

РОЗРАХУНКОВО-ГРАФІЧНА ЧАСТИНА

Розділ 3. Визначення показників росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів

3.1 Визначення параметрів кривої росту

3.2 Визначення типу живлення

3.3 Визначення константи швидкості поділу та тривалості генераці

Розділ 4. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів

4.1 Склад поживного середовища

4.2 Розрахунок теоретично-можливого рівня біомаси

Розділ 5. Енергетичний баланс окиснення субстрату

ВИСНОВКИ

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

Вступ Біотехнологія (слово походить від грецьких bios — життя, techne — мистецтво, майстерність і logos — слово, навчання) — використання живих організмів та біологічних процесів у виробництві. Біотехнологія — міждисциплінарна галузь, що виникла на стику біологічних, хімічних і технічних наук. З її розвитком пов’язують вирішення глобальних проблем людства — ліквідацію недостачі продовольства, енергії, мінеральних ресурсів, поліпшення стану охорони здоров’я і якості навколишнього середовища[1].

Під «використанням живих організмів» мається на увазі, перш за все, використання їх біохімічних процесів (їх метаболізму) з метою отримання різних продуктів. Варто також сказати, що біотехнологія використовується також для синтезу речовин, що вже отримуються іншими шляхами (наприклад, хімічним), але з меншими матеріальними та трудовими затратами. Україна чи не єдина Європейська держава, яка нині не приділяє належної уваги формуванню ринку біотехнологічної продукції. Сучасний стан біотехнологічної галузі України характеризується наявністю науково-технологічного потенціалу і практично повною відсутністю структури, яка б сприяла широкому впровадженню біотехнологічних розробок. Тому медична, сільськогосподарська та промислова галузі, які використовують мікробні біотехнологічні препарати і процеси майже повністю залежить від постачання цієї продукції із-за кордону[2]. Для створення повноцінної біотехнологічної продукції та її реалізації в економіці в інститутах відсутні відповідні умови і кошти, а в державі органи і організації, які б заповнювали проміжок між інститутами і підприємствами. Це є однією із причин низької інноваційної активності вітчизняних виробників біотехнологічної продукції, в тому числі представників малого і середнього підприємництва. Вони не можуть ризикувати своїм бізнесом через переважну непідготовленість науково-технічних розробок і винаходів до їх безпосереднього впровадження у виробництво. До цього ще й додається недосконала система контролю за авторськими правами, що дозволяє нечесним підприємцям використовувати розробки інститутів без їх дозволу.

Експерти прогнозують значне розширення впливу результатів досліджень у галузі біотехнології на провідні напрями науково-технологічного розвитку в сучасному світі. Вони звертають увагу на те, що роль сучасної біотехнології є вирішальною для становлення цілого ряду високотехнологічних виробництв, а отже, для забезпечення структурної трансформації економіки України у бік нарощування в ній сектору високих технологій. Для цього є необхідний науковий потенціал: нині в Україні успішно розвивається низка напрямів біотехнології і в них досягнуто здобутків світового рівня. Найбільш успішними з-поміж них і такими, результати яких можуть бути активно використані на практиці у прогнозованому періоді, названо: технології виробництва біопалива, біодеструкції та утилізації відходів, створення пробіотиків, біофармакологічні, генно-інженерні, діагностичні розробки. При цьому розробки в галузі клітинних та генних технологій, а також імунобіотехнології є цілком конкурентоспроможними у світі й можуть стати основою для виведення вітчизняних товарів і технологій на міжнародний ринок. Використання біотехнологічних розробок зробить можливим у найближчі роки розв’язання цілого ряду актуальних завдань сучасної медицини, сільського господарства, фармакології, екології, низки галузей промисловості, особливо тих, що пов’язані з життєдіяльністю людини та станом довкілля.

У наш час мікробіологія з повним правом вважається однією з основних дисциплін біології, оскільки без знань особливостей мікроорганізмів неможливо зрозуміти всієї різноманітності життя на Землі, умов його появи та еволюції[2]. Вивчення мікроорганізмів за останні роки зробило суттєвий внесок у вирішення важливих проблем загальної біології. Мікроорганізми досить зручні у роботі. Завдяки швидкому росту, високій здатності до адаптації та ряду інших цінних властивостей вони є улюбленим об'єктом досліджень для біохіміків та генетиків. Велику роль мікроорганізми відіграють у розвитку таких наук, як молекулярна біологія, біофізика, екологія та ін.

Виникнення і швидкий розвиток біотехнології ґрунтується насамперед на використанні мікроорганізмів як продуцентів практично цінних продуктів (антибіотики, ферменти, органічні кислоти, амінокислоти, вітаміни, полісахариди та ін.).

Цікавим напрямком на даний момент є також виробництво глутамінової кислоти яка є найпоширенішою амінокислотою в організмі, становить більше 60 відсотків вільних амінокислот в скелетних м’язах і більш ніж 20 відсотків загальної кількості циркулюючих амінокислот. Також глутамінова кислота використовується як харчова добавка (E620) та її солі (глутамат натріюЕ621, глутамат калію Е622, діглутамат кальцію Е623, глутамат амонію Е624, глутамат магніюЕ625) використовуються як підсилювачі смакув багатьох харчових концентратах і консервах[2]. Отже застосувань у глютамінової кислоти є дуже багато і потреби світового ринку у її виробництві є значні. А оскільки продукти мікробіологічної промисловості є значно дешевшими за своїх конкурентів, то створення проектів на тему виробництва глютамінової амінокислоти за допомогою надсинтезуючих штамів мікроорганізмів є надзвичайно актуальними на даний момент.

Загальна частина Розділ 1. Обгрунтування вибору біологічного агенту У 1957 році японcький вчений С. Кіносіта виділив мікроорганізм Corinebacterium glutamicum і тим самим відкрив нову епоху у промисловому використанні процесів неповного окиснення. Ця бактерія є продуцентом L-глутамінової кислоти. L-глютамінова кислота синтезується дикими штамами бактерій Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, з порушеною ферментативною системою перетворення 2-оксоглутарату в сукцинат. Відомі продуценти L-глютамінової кислоти C. glutamicum з високою супероксидисмутазной активністю (патент Японії 5−29 436 C 12 P 13/14), які продукують до 100 г/л глютамінової кислоти одержаної мутантом C. glutamicum, що містить рекомбінантний ДНК з фрагментом, що несе ген, що кодує фосфоенолпіруваткарбоксилазу з Escherichia coli (патент Японії 4−17 639 C 12 P 13/14).Основним недоліком всіх перерахованих штамів і мутантів є непродуктивна витрата вуглецевмісних субстратів на біосинтез молочної кислоти, при цьому при культивуванні всіх наведених штамів вихід глютамінової кислоти від субстратів становив не більше 56%.

Кращим є штам C. glutamicum 541P .Штам мікроорганізмів 5413 вирощували на лабораторній установці ФС-5, що вміщає 2,0 л середовища. Ступінь аерації забезпечували шляхом зміни числа обертів мішалки від 400 до 800 обертів за хвилину, повітря подавали в кількості від 1 до 3 обсягів повітря на 1 обсяг живильного середовища в 1 хв. Середовище вирощування містила: 10% цукру, 0,1% KH2PO4,0,1% K2HPO4,0,05% MgSO4· 7H2O, 0,001% MnSO4· 4H2O, 1,5% сечовини, 0,15% кукурудзяного екстракту. Вирощування вели 72 год, при цьому синтезувалося 46,9 г / л L-глютамінової кислоти. Вихід склав 47%. Недоліком цього штаму є низький вихід цільового продукту від поданих вуглецевмісних субстратів. Пропонований новий штам бактерій C. glutamicum був отриманий мутацією штаму АТСС 4128, отриманого з Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів Державного науково-дослідного інституту генетики. Клітини вихідного штаму піддавали УФ-мутагенного впливу. Відбір проводили за допомогою біоавтографіческого методу. Бактеріальні клітини, які виросли на чашках, вбивали УФ-опроміненням, після цього чашки заливали агаризованим середовищем, що містить суспензію клітин штаму, що потребує L-глютамінову кислоту. Зростання такої індикаторної бактерії підтверджувало виділення досліджуваним штамом L-глютамінової кислоти. Прямий відбір серед 100 варіантів, отриманих після обробки клітин вихідного штаму АТСС 4128, дозволив виявити 8 штамів, що володіють здатністю до синтезу L-глютамінової кислоти, далі мутанти відбиралися за двома ознаками: резистентності до нaтріевой солі ампіциліну і виходу від поданого вуглецьвмісного субстрату більше 60%. При вирощуванні на рідкому синтетичному живильному середовищі з додаванням джерел N, P, K, Na, Mg, біотину, тіаміну, що містить сахарозу в кількості 40 г / л, був відібраний штам ВСБ-206л, здатний до надсинтезу L-глютамінової кислоти з виходом від спожитої сахарози 63%.Відібраний штам був ідентифікований відповідно до визначником (Starr MP, Stolp H., Trupper HG, Salows A., Schlegel HG, (1981) The Prokaryotes A. Handbook on Habitats. Isolation and ldentification of Bacteria, Bd 1, 2, Springer Verlay, Berlin, New York) як C. glutamicum. Штам С. glutamicum (ВСБ-206л) депонований у Всеросійській колекції промислових мікроорганізмів Державного науково-дослідного інституту генетики під номером В-7198.Поживне середовище для підтримки штаму: сахароза — 10%, KH2PO4- 0,1%, K2HPO4- 0,1%, MgSO4· 7H2O — 0,05%, MnSO4· 4H2O — 0,001%, сечовина — 1,5%, кукурудзяний екстракт — 0,25%. Спрямований біосинтез L-глютамінової кислоти проводили у ферментері V = 5л при перемішуванні (1200 об / хв) і аерації (0,6 м3/ год) при pH = 6,8 і T = 30oC. Склад живильного середовища для стадії спрямованого біосинтезу L-глютамінової кислоти був наступним: сахароза — 8 — 15%, KH2PO4- 0,1 — 0,2%, K2HPO4- 0,1%, MgSO4· 7H2O — 0,02%, MnSO4· 4H2O — 0,001%, ZnSO4· 7H2O — 0,01%, сечовина — 1%, кукурудзяний екстракт — 1%. Посівний матеріал готували шляхом вирощування однодобової культури бактерій на вищенаведеному середовищі і підтримували титруванням 5%-ним NaOH. Синтезували максимально 67 г/л L-глутамінової кислоти, при цьому вихід від поданої сахарози склав 72%, що вище, ніж у прототипів на 20%.

Приклад 1. Штам бактерій C. glutamicum B-7198 культивували в періодичній культурі в лабораторному ферментері з робочим об'ємом 5 л на поживному середовищі: сахароза — 10%, KH2PO4- 0,1%, K2HPO4- 0,1%, MgSO4· 7H2O — 0,02%, MnSO4· 4H2O — 0,001%, кукурудзяний екстракт — 0,2%, сечовина — 1,5% при pH = 6,9, T = 30oC, аерації 0, 6 м3/ год, перемішуванні 1200 об / хв. pH підтримували титруванням 0,5%-ним NaOH, при цьому було синтезовано 63 г/л L-глутамінової кислоти й вихід склав 63%.

Приклад 2. Штам бактерій B-7198 вирощували так само, як і в прикладі 1, але в якості джерела вуглецю використовували етиловий спирт у кількості 7%, було синтезовано 45 г/л глутамінової кислоти, а вихід склав 64%.

Таким чином, на підставі проведених досліджень можна зробити висновок, що пропонований штам Corynebacterium glutamicum B-7198 є новим штамом, що володіє здатністю до надсинтезу L-глутаміновой кислоти і характеризується відмінними ознаками від прототипів:синтезує L-глютамінову кислоту в кількості 60 — 70 г/л, вихід від поданого вуглецьвмісного субстрату склав 61 — 67%, володіє зниженим біосинтезом лактатдегідрогенази. На підставі даних проведених досліджень штам бактерій C. glutamicum B-7198 рекомендований як продуцента при виробництві L-глютамінової кислоти.

Розділ 2. Характеристика біологічного агента Одним з напрямів розвитку науково-технічного прогресу є перехід від хімічної технології до біотехнології, що дозволяє отримувати відомі речовини і матеріали, що відрізняються високою якістю і низькою собівартістю, а також синтезувати нові продукти. Одним з прикладів цьому служить виробництво L-глутамінової кислоти. Дана амінокислота вироблялася методом екстракції з морських водоростей, і відкриття мікроорганізмів, здатних продукувати глютамінову дало можливість здійснення економічно вигідного мікробіологічного способу її виробництва. L-глутамінова кислота, а точніше її натрієва сіль, широко використовується в харчовій промисловості. Глутамат натрію харчова добавка Е621 застосовується для поліпшення смакових якостей м’ясних і овочевих блюд. Його використовують при консервації, заморожуванні або тривалому зберіганні. У медичній практиці L-глутамінова кислота знаходить вживання в лікуванні хвороб центральної нервової системи: епілепсії шизофренії, депресії. Впродовж останніх 50-ти років особливий інтерес викликає мікробіологічне виробництво L-глутамінової кислоти під впливом стресових дій, недоліку біотину в культуральному середовищі, додавання поверхнево-активних речовин, антибіотиків, дії теплового шоку. Вплив кожного з перерахованих чинників приводить до збільшення проникності оболонки бактерій і зміни метаболізму клітин таким чином, що потік вуглецьвмісного субстрата прямує на синтез L-глутамінової кислоти. Найцікавіше виробництво L-глутамінової кислоти корінеформнимі бактеріями під дією теплового шоку, оскільки цей спосіб при визначених особливих умовах забезпечує набуваюття найбільш високих виявлень продуктивності.

Корінеформні бактерії це грам позитивні паличкоподібні форми, схильні до морфологічної мінливості зутворенням булавоподібних, слабко розгалужених клітин, які часто розміщуються під кутом у вигляді літер V, Y. Мають також вигляд неправильних паличок, які переходять у кокоподібні форми (кок — паличка — кок). Більшість нерухливі, некислостійкі, хемоорганогетеротрофи, переважно облігатні аероби. Бактерії роду Corynebacterium — є аеробними органотрофами. Існують у грунті, воді, повітрі, ряд видів є збудниками хвороб послин тварин і людини (наприклад, збудник дифтерії - Corynebacterium diphtheria).

Рід Corynebacterium був описаний у 1896 р. Lehmann і Neumann, до нього належать 75 видів морфологічно подібних споріднених мікроорганізмів, утому числі і збудник дифтерії. Це здебільшого коменсали слизових оболонок та шкірних покривів людей і тварин. Вуглецевий метаболізм змішаний — бродильний та дихальний.

Найбільшого практичного значення набув вид C.glutamicum. Деякі характеристикиC. glutamicumроблять його корисним в біотехнології.Цей вид не патогенний, не утворює багато спор, швидко росте, має відносно невелике число вимог зростання, не має позаклітинної секреції протеази, і має відносно стабільний геном.

С. glutamicumвиробляє кілька корисних сполук і ферментів. Він був вперше виявлений в якості продуцента глутамату. Тепер С. glutamicum також використовується, для виробництва амінокислот, таких як лізин, треонін, і ізолейцин, а також вітамінів (пантотенат).

Систематика С. glutamicum. Згідно з дев’ятим виданням керівництва Бергі з систематики бактерій С. glutamicum відноситься до відділу Firmicutes, класу Thallobacneria, роду Corynebacterium. Але у 80-х роках була складена філогенетична класифікація на основі аналізу 16S р-РНК. За цією класифікацією С. glutamicumпосів таке місце (таб.6.1).

Таблиця 2.1

Місце С. glutamicum у філогенетичній класифікації

Розглянемо морфологокультуральні та фізіолого — біохімічні ознаки бактерій виду Corynebacterium glutamicum.

Рис. 2.1.Вид С. glutamicum у електронному мікроскопі

Морфологічні ознаки. форма клітин булаво подібна, здатні до розгалуження, розмір клітин не перевищує 2−3 мкм. Corynebacterium glutamicum бактерії це грампозитивні паличкоподібні форми (Вони мають вигляд прямих або злегка вигнутих паличок), схильні до морфологічної мінливості з утворенням булавоподібних, слабко розгалужених клітин, які часто розміщуються під кутом. Мають також вигляд неправильних паличок, які переходять у кокоподібні форми (кок — паличка — кок). У мазках, як правило, розташовуються поодиноко або у парах, часто V-подібної конфігурації, бувають у купках із декількох паралельно розташованих клітин. Їх цитоплазма нерівномірно забарвлюється і може мати метахроматичні гранули. Зазвичай ці мікроорганізми нерухливі. Клітинна стінка на 70% складається з пептидоглікану, також вона містить мезодіаміно-пімелінову кислоту, арабіногалактан та коротколанцюгові міколові кислоти. Як і для інших грампозитивних бактерій для С. glutamicumхарактерна навність тейхоєвих кислот. Вміст ліпідів і білків невисокий.

Цитоплазматична мембрана являє собою подвійний шар білків з зануреними у неї інтегральними білками. Периферійні білки розміщені на поверхні мембрани. Мезосоми розвинуті добре.

Майже вся генетична інформація клітини розміщена у вигляді в молекули ДНК, що має форму ковалентно замкнутого кільця (бактеріальний нуклеоїд).

Рибосоми мають розмір 16Ч18 нм. Приблизно 80−85% всієї бактеріальної РНК міститься у рибосомах. Складаютьс з білка (35 — 40%) та РНК (60 — 65%). При ультрацентрифугуванні осідають зі швидкістю 70 одиниць Сведберга.

У певних умовах середовища можуть накопичуватися речовини, які можуть розглядатис як запасні - полісахариди, жири, полі фосфати та сірка.

Культуральні ознаки.: колонії на м’ясо-пептонному агарі при температурі 30 — 32oC блискучі, жовтого кольору, з рівним краєм, розмір колоній не перевищує 5 мм через 3 доби після висіву.

Фізіологічні ознаки. За типом живлення С. glutamicum є хемоорганотрофи. Ростовим субстратом для них є органічні речовини, адже вони для них являються джерелом вуглецю, електронів та енергії.

По відношенню до рН середовища вони являються нейтрофілами, причому при зниженні кислотності середовища у них відразу спостерігається припинення росту, а при подальшому зниженні рН С. glutamicum гинуть.

По відношенню до кисню С. glutamicuт є облігатним аеробом. У цього мікроорганізма присутні ферменти проти ВРО (вільно-радикальне окислення):каталаза, пероксидаза, супероксоддисмутаза. Енергія отримується при перенесенні електронів по дихальному ланцюгу.

Оптимальною температурою культивування є 30oC, це пояснюється тим що даний мікроорганізм є мезофілом.

Розмноження. Для С. glutamicuт характерний бінарний поділ клітини навпіл. Перед поділом відбувається подвоєння молекули ДНК, яке починається з моменту прикріплення нуклеоїду до ЦПМ або до її мезосоми. На мезосомі або ЦПМ знаходиться ген-реплікатор, з якого починається подвоєння мезосоми, гена реплікатора, деспіралізація ДНК, побудова нових ниток ДНК та розходження хромосом до полюсів клітини. Потім формується поперечна перегородка від периферії до центру, і як наслідок утворюються дві дочірні клітини.

Також С. glutamicuт спостерігається і статеве розмноження. Статеве розмноження бактерій відрізняється від статевого розмноження еукаріот тим, що у бактерій не утворюються гамети і не відбувається злиття кліток. Проте найголовніша подія статевого розмноження, а саме обмін генетичним матеріалом, відбувається і в цьому випадку. Цей процес називається генетичною рекомбінацією. Частина ДНК (дуже рідко вся ДНК) клітки-донора переноситься в клітку-реципієнта, ДНК якої генетично відрізняється від ДНК донора. При цьому перенесена ДНК заміщає частину ДНК реципієнта. В процесі заміщення ДНК беруть участь ферменти, розщеплюючі і знов сполучаючі ланцюги ДНК. При цьому утворюється ДНК, яка містить гени обох батьківських кліток. Таку ДНК називають рекомбінантной. В потомства або рекомбінантів, спостерігається помітна різноманітність ознак, викликана зсувом генів. Така різноманітність ознак дуже важлива для еволюції і є головною перевагою статевого розмноження. Відомі 3 способи здобуття рекомбінантів. Це — в порядку їх відкриття — трансформація, кон’югація і трансдукція.

Розрахунково-графічна частина Розділ 3. Визначення показників швидкості росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів

3.1 Визначення параметрів кривої росту Визначити:

· Швидкість росту (м) між 24 та 32 год. культивування;

· Рівень біомаси;

· Економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація глюкози в середовищі становить 0,28 М;

· Тривалість лаг-фази.

При внесенні у поживне середовище бактерії ростуть до тих пір, поки вміст якого-небудь необхідного компонента не стане мінімальним або не вичерпається, після чого ріст припиняється. Якщо впродовж усього цього часу в середовище не вносити ніяких поживних речовин і не виводити продукти метаболізму, то одержимо так звану періодичну культуру (популяцію клітин в обмеженому життєвому просторі).

Визначення швидкості експоненційного росту Експоненційна фаза характеризується максимальною швидкістю поділу клітини. У цій фазі процеси росту проходять збалансовано (тобто подвоєння біомаси супроводжується подвоєнням кількості білка, ДНК, РНК та ін.). Можна сказати, що культура в експоненційній фазі складається із «стандартних» клітин. Але треба мати на увазі, що і в експоненційній фазі клітини періодичної культури зазнають змін, оскільки постійно змінюється середовище: зменшується концентрація субстрату, збільшується густина клітинної суспензії, накопичуються продукти обміну. У зв’язку з тим що в цій фазі швидкість поділу відносно постійна, вона найзручніша для визначення швидкості поділу та швидкості росту. Вплив факторів зовнішнього середовища, складу поживного середовища на ріст мікроорганізмів визначають, спостерігаючи за показником біомаси чи кількістю клітин саме під час експоненційного росту.

Швидкість експоненційного росту — це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі.

Швидкість росту розраховують за формулою м=2,3?(lgXtlgX0)/(tt0) виходячи з величин початкової і кінцевої біомаси X0 та Xt у моменти часу t0 та t. Згідно з умовою t=32 год. t0=24 год. Визначаємо за графіком концентрацію біомаси у моменти часу t та t0: Xt=3.4; X0=2,5 г/л.

Отже, м=2,3•(lg3,4-lg2,5)/(32−24)= 0,043 год-1.

Визначення рівня біомаси Рівень біомаси (концентрація біомаси) — це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі) та вихідною біомасою бактерій: X=Xмакс.-X0

Виходячи із цієї формули знаходимо біомасу:

X=5−0,6=4,3 г/л.

Біомасу визначають за допомогою прямих і не прямих методів. У повсякденній практиці перевага надається непрямим методам (з використанням відповідного калібрувального графіка). Розглянемо детальніше прямі і непрямі методи визначення біомаси.

Існує кілька прямих методів визначення біомаси :

Ш сиру біомасу визначають після осадження клітин центрифугуванням. Після висушування відмитих клітин можна визначити суху біомасу ;

Ш визначення загального азоту (наприклад, за методом К'єльдаля) або загального вмісту вуглецю (наприклад, за методом Тюріна) ;

Ш визначення вмісту білка (наприклад, за допомогою біуретового методу, методу Лоурі чи Фоліна).

Серед непрямих методів відомі наступні:

Ш біомасу визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на суху біомасу за допомогою калібрувального графіка ;

Ш визначення показників інтенсивності метаболізму, безпосередньо пов’язаних з ростом (поглинання кисню, утворення СО2).

Визначення економічного коефіцієнта Відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату (якщо ці дві одиниці виражені у відсотках) називають економічним коефіцієнтом. Економічний коефіцієнт може бути розрахований також як відношення біомаси до заданого субстрату. Якщо в рожай у грамах відноситься до кількості молей спожитого середовища, то одержану величину називають молярним економічним коефіцієнтом. Згідно з умовою початкова концентрація глюкози в середовищі становить 0,28 М, або 0,28 Ч180 =50,4 г/л (молекулярна маса глюкози становить 180). Рівень біомаси становить 4,3 г/л, отже, економічний коефіцієнт становить Y=X/S=4.3/50.4=0,085 або 8,5%.

Тривалість лаг-фази Тривалість лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом tr, в який культура досягла певної біомаси Xr, і моментом часу tt, в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби відразу ж після інокуляції починався експоненційний ріст. Для цього на експоненційній кривій росту проводимо теоретичну криву:

Тривалість лаг-фази визначаємо за формулою T= tr-((lnXr-lnX0)/м),

де м=(2,3?(lgXr-lgXt))/(trtt), за умовою X0=0.6 г/л; приймемо Xr таким, що дорівнює 3 г/л. На реальній і теоретичній кривих визначаємо час tr і tt, необхідний для досягнення 3 г/л біомаси: tr=28 год, а tt=18 год. Швидкість росту розрахуємо за першою формулою для реальної кривої в інтервалі часу tr=28 год. та tt=18 год. За реальною кривою визначаємо Xr=3 г/л; Xt =1.1 г/л. Отже, швидкість росту:

м =(2,3?(lg3-lg1.1))/(28−18) =2.3· 0.44/10=0.1 год-1.

Знаючи швидкість росту, можна визначити тривалість лаг-фази:

T=28-(ln3-ln0.6)/0,1=28 — 1,8/0.1=28−18=10 год.

Отже, тривалість лаг-фази становить приблизно 10 год.

3.2 Визначення типу живлення Назвіть тип живлення, якщо джерелом енергії є глюкоза, джерелом вуглецю глюкоза і донором електронів — молекулярний водень.

У класифікації типів живлення у мікроорганізмів використовують термінологію, запропоновану в 1946р. на симпозіумі у Колд Спринг Харбор. Розглядають типи живлення (трофії) щодо:

Джерела енергії (хемо — хімічне, фото — світлове).

Донора електронів (органо — органічна речовина, літо — неорганічна; неорганічними донорами електоронів є H2, NH3, H2S, СО та ін.)

Джерела вуглецю (авто — вуглекислота, гетеро — органічна сполука).

Отже, щодо джерела енергії даний тип живлення можна визначити, як хемотрофія, щодо джерела карбону тип живлення визначають як гетеротрофію, щодо донора електронів — як літотрофію .

Отже, даний тип живлення називається хемолітогетеротрофія.

3.3 Визначення константи швидкості поділу і тривалості генерації

Визначити константу швидкості поділу (v) та тривалість генерації(g), якщо:

початкова концентрація клітин становить 103, а через 12 год-1011

Бактерії розмножуються бінарним поділом, тому їхня кількість збільшується в геометричній прогресії: 2є?2№?2І?2і… 2n.

Якщо на одиницю об'єму періодичної культури, що росте, припадає N0 клітин, то після n поділів кількість клітин стане N0 •2?. Логарифмуючи, отримаємо

lg N= lg N0+ n• lg2, звідки кількість клітинних поділів:

n= (lg Nlg N0) / lg2.

Кількість клітинних поділів за 1 год. (константа швидкості поділу v) визначають за формулою:

v= n / t = (lg Nlg N0) / lg2• (t-t0).

Тривалість генерації (час, необхідний для одного циклу поділу) визначають за формулою :

g= t / n = 1/ v.

Якщо за 12 годин кількість клітини у середовищі збільшується з 103 до 1011, то константа швидкості поділу

v=(lg1011-lg103) / 0.3010• 12= (11−3)/3.612=2.21 год-1.

тривалість генерації g=1 / 2.21=0.45 год=27 хв.

Розділ 4. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів

4.1 Склад поживного середовища Чи правильно вказаний склад поживного середовища (г/л)? Якщо так, для вирощування яких мікроорганізмів це середовище може бути використане?

NaCI — 20%;

NH4CI — 1,8;

MgSO4Ч7H2O — 1,0;

CaCI2Ч2H2O — 0,5;

FeCl3 Ч6H2O — 0,001;

Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, повинні відповідати таким вимогам: у них мають бути присутні всі елементи, з яких будується клітина, причому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати.

До складу бактеріальної клітини входять такі елементи, % до маси сухої речовини: вуглець — 50; азот — 10 — 14; водень — 8; фосфор — 3; сірка, калій, натрій — 1; кальцій, магній, хлор — 0,5; залізо — 0,2; решта елементів — близько 0,3.

Тільки невелика кількість елементів періодичної системи потрібна мікроорганізмам у відносно високих концентраціях (?10−4М). Це десять головних біоелементів: вуглець, кисень, водень, азот, сірка, фосфор, калій, магній, кальцій та залізо. Крім десяти головних біологічних елементів, мікроорганізмам необхідні мінорні біоелементи, джерелом яких як правило є водопровідна вода.

У середовищі наведеного складу хлорид натрію є джерелом натрію, хлорид амонію-нітрогену, сульфат магнію-магнію та сульфуру, хлорид кальцію-кальцію, хлорид феруму-феруму, оксиген і гідроген містяться у воді. Не вистачає таких головних біологічних елементів, як карбон і фосфор. Джерелом карбону може виступати вуглекислий газ, що міститься в повітрі, але середовище все одно не містить фосфору, який є компонентом нуклеїнових кислот, фосфоліпідів та нуклеотидів.

Отже, дане поживне середовище наведеного складу непридатне для вирощування мікроорганізмів.

4.2 Визначення теоретично-можливого рівня біомаси Концентрація нітрату амонію в середовищі для вирощування бактерій становить 0.8 г/л, а глюкози — 45 г/л. Розрахуйте теоретично можливий рівень біомаси.

В даному випадку глюкозу вважатимемо головним чином як джерело карбону, а нітрат амонію — як джерело нітрогену. Для розрахунку теоретично можливого рівня біомаси розрахуємо спочатку вміст елементарного нітрогену в нітраті амонію. Молекулярна маса NH4NO3 дорівнює 80. Отже, у 80 г нітрату амонію міститься 14· 2=28 г нітрогену, тоді у 0,8 г нітрату амонію міститься нітрогену ХN=0.8· 28/80=0,28 г нітрогену. Якщо вважати, що в біомасі міститься 10% нітрогену, то з 0,28 г нітрогену можна одержати 2,8г/л біомаси.

Розрахуємо тепер теоретично можливий рівень біомаси по карбону:

Молекулярна маса С6Н12О6 становить180, отже, у 180 г глюкози міститься 12· 6=72 г карбону. Тоді в 45 г глюкози міститься карбону ХС=45· 72/180=18 г.

Якщо вважати, що половина глюкози іде на отримання мікроорганізмом енергії, то виходить, що для росту біомаси може бути використано лише 9 г карбону.

Оскільки вміст карбону у клітині становить приблизно 50%, то виходить, що на даному середовищі може утворитися 18 г/л біомаси.

Отже, в даному випадку лімітувальним фактором виступає вміст нітрогену в середовищі. Теоретично можливий рівень біомаси — 2,8 г/л.

Розділ 5. Енергетичний баланс окислення субстрату Скласти енергетичний баланс окислення глюкози за наступних умов:

а) Катаболізм глюкози здійснюється через глюконат;

б) Р/О=1.

в)глюконокіназа відсутня г) глюкозодегідрогеназа є НАДФ±залежним ферментом.

Аналіз окисно-відновних потенціалів (див. таблицю) показує, що у дихальному ланцюгові є тільки три етапи окиснення, на яких вивільнюється стільки енергії, скільки міститься в одному макроергічному зв’язку

Таблиця 5.1

Компоненти дихального ланцюга

Р/О — це число молекул АТФ, утворюваних у розрахунку на один атом кисню. У мітохондріальному дихальному ланцюгові цей коефіцієнт дорівнює трьом, якщо донор електронів є НАДН, і двом, якщо донор електронів ФАД. Відомі навіть пункти утворення АТФ (див. таблицю): дегідрування НАДН, окиснення цитохрому b та окиснення цитохрому а. Знаючи співвідношення Р/О, можна скласти енергетичний баланс окиснення субстрату.

Глюкоза

1 НАДФН Глюконат

2 НАД (Ф)Н

2-Кетоглюконат

3 АТФ

2-кето-6-фосфоглюконат

4 НАД (Ф)Н

6-фосфоглюконат

2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат

6 Піруват Гліцеральдегід-3-фосфат

7 НАДН

1,3-дифосфогліцерат

8 АТФ

3-фосфогліцерат

2-фосфогліцерат

Фосфоенолпіруват

11 АТФ Піруват Рис. 5.1.Розщеплення глюкози через глюконат

1)глюкозодегідрогеназа, 2) глюконатдегідрогеназа, 3) кетоглюконаткіназа, 4)2-кето-6-фосфоглюконатдегідрогеназа, 5) фосфоглюконатдегідратаза, 6)2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза, 7) — гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа, 8) фосфогліцераткіназа, 9) гліцератфосфомутаза та фосфогліцератфосфомутаза 10) енолаза, 11) піруваткіназа.

Сумарна реакція розщеплення глюкози за розщепленням через глюкнат:

Глюкоза > 2 Піруват + АТФ + НАДН + НАДФН .

Далі піруват окислюється до ацетил-КоА, який далі окис-люється у циклі Кребса.

Підрахуємо кількість відновлювальних еквівалентів, при цьому кількість НАДФН враховувати не будемо, вважатимемо, що НАДФН повністю іде на реації конструктивного метаболізму і для синтезу АТФ не використовується:

При окисленні глюкози до пірувату — 1 моль НАДН;

При дегідруванні пірувату — 2 моль НАДН;

У циклі трикарбонових кислот — 2Ч3=6 моль НАДН і 2 моль ФАДН.

Рис. 5.2.Цикл три карбонових кислот Ферменти: 1- піруватлегідрогеназа; 2 — цитратсинтаза; 3 — аконітаза; 4- ізоцит-ратдегідрогеназа; 5- 2-оксоглутаратдегідрогеназа; 6- сукцинаттіокіназа; 7- сук-цинатдегідрогеназа; 8 — фумараза; 9 — малатдегідрогеназа.

При Р/О, рівному 1, кількість АТФ становитиме:

9Ч1+2Ч1=11 моль АТФ. Якщо до цього добавити 1 моль АТФ, яка синтезувалася в КДФГ-шляху, та 2 моль АТФ, які утворюються у циклі Кребса, одержимо 11+3=14 моль АТФ.

Отже, при окисленні 1 моль глюкози за заданим шляхом утвориться 14 моль АТФ.

ВИСНОВКИ

1. У загальній частині даної курсової роботи було розглянуто бактерію виду Corynebacterium glutamicum, яка використовується для виготовлення глютамінової кислоти.

2. Розглянуто загальні характеристики даного мікроорганізму, його морфо-фізіологічні властивості та таксономічний статус.

3. В розрахунково-графічній частині визначили показники росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів та отримали такі результати:

Швидкість росту між 24 та 32 год культивування становить 0,043 год-1.

Рівень біомаси дорівнює 4,3 г/л.

Економічний коефіцієнт становить 8,5%

Тривалість лаг — фази — 10 год.

4. Встановлено тип живлення: джерела вуглецю — глюкоза (органічна сполука) тип живлення визначають як гетеротрофію, що до джерела енергії - теж глюкоза (органічна сполука) тип живлення — хемотрофія, донором електронів виступає молекулярний водень, тому літотрофія. Тип живлення — хемолітогетеротрофія.

5. Константа швидкості поділу () та тривалість генерації (g) відповідно становлять 2,21 год-1 та 27 хв.

6. Наведене в завданні поживне середовище непридатне для росту жодних мікроорганізмів, тому що у ньому немає фосфору і карбону.

7. Теоретично можливий рівень біомаси становить 2,8 г/л.

8. При катаболізмі глюкози за гліколітичним шляхом за умови, що Р/О дорівнює 1, кількість синтезованих АТФ дорівнює 14 моль.

Література

1. Быховский В. Я. Микробиология. — М.: Мир, 1998. — 320 с.

2. «Біотехнологія: перспективи розвитку», Маруненко І.М., № 7, 1997

3. Определитель бактерий Берги. — 9-е изд. / Пер. под. ред. Г. А. Заварзина. — М.: Мир, 1997. — Т. 1, 2. — 800 с.

4. Пат. 2 107 723 РФ НИИ C12N1/20 штам бактерий Corynebacterium glutamicum В-7198-продуцент L-глютаминовой кислоты / Винаров А. Ю.; Сидоренко Т. Е.; Яшина В. Н.; Гордеева Е. И. — опубл. 27.03.98

5. Пирог Т. П. Загальна мікробіологія: Підручник. — К.: НУХТ, 2004. — 471 с.

6. Пирог Т. П., Ігнатова О. А. Загальна біотехнологія: Підручник. — К.: НУХТ, 2009. — 336 с

7. «Промышленное освоение биотехнологии» — Казаку кейдзай, 1989, № 8, 164 ст.

8. Fanous A., Weiland F., Lьck C. Chemosphere, 69(2007), 1, 25−31

9. HдnЯler E., Mьller T., Palumbo K., Journal of Biotechnology, 142(2009), 2, 114−122