Вітаміни. 
Основи біотехнології. О 2 год. 
Частина 2 -

Витамины — это низкомолекулярные органические вещества, способные в очень низких концентрациях оказывать сильное и разнообразное воздействие на живые организмы. Они принимают активное участие в метаболизме человека и высших животных, оказывая влияние на различные физиологические процессы (цикл трикарбоновых кислот, распад и синтез жирных кислот, синтез аминокислот и др.). Природным источником многих витаминов являются растения и микроорганизмы.

В производстве многих витаминов ведущие позиции занимает химический синтез. Кроме того, для получения отдельных витаминов огромное значение имеет микробный синтез, например при производстве кормовых препаратов витаминов. Микробиологическим путем получают некоторые витамины группы В, а также эргостерин и каротин, являющиеся, соответственно, предшественниками витамина D₂ и провитамина А.

Получение витамина В₁₂. Витамин В₁₂ (а-5,6-диметил-бензимидазол (ДМБ)-цианокобаламин) необходим для роста и развития многих животных и микроорганизмов (рис. 6.12). Способность к его синтезу широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Активно продуцируют витамин В₁₂ Propionibacterium, а также Pseudomonas и смешанные культуры метанобразующих бактерий.

Рис. 6.12. Формула витамина В12.

Микробиологический синтез — единственный способ получения витамина В₁₂ — осуществляют в две стадии на основе пропионовокислых бактерий, способных к самостоятельному синтезу коэнзима В₁₂ (аденозилкобаламина 5,6 ДМБ). Первую стадию культивирования проводят в течение 80 ч в анаэробных условиях и при слабом перемешивании (до полной утилизации сахара). Полученную биомассу центрифугируют и сгущенную суспензию инкубируют во втором аппарате еще в течение 88 ч, аэрируя культуру воздухом (2 м³/ч). Питательная среда содержит сахара (обычно глюкозу, 1—10%), добавки солей железа, марганца, магния и кобальта (10—100 мг/л), кукурузный экстракт (3—7%) и азот в виде (NH₄)₂S0₄. Ферментацию проводят при 30 °C и pH 6,5—7,0. На второй стадии происходит образование ДМБ. После завершения ферментации витамин извлекают из клеток нагреванием в течение 10—30 мин при 80—120 °С. При последующей обработке горячей клеточной суспензии цианидом происходит образование CN-кобаламина. Продукт сорбируют, пропуская раствор через активированный уголь и окислы алюминия, а затем элюируют водным спиртом или хлороформом. После выпаривания растворителя получают кристаллический витамин В₁₂, выход которого достигает 40 мг/л.

Разработаны эффективные технологии получения витамина В₁₂ и на основе термофильных бацилл Bacillus circulans, которые выращивают в нестерильных условиях в течение 18 ч при 65—75 °С на питательных средах, приготовленных из соевой и рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. Выход витамина составляет от 2,0 до 6,0 мг/л.

Для нужд животноводства витамин В₁₂ получают на основе смешанной ассоциации, состоящей из четырех культур — углеводсбраживающих, аммонифицирующих, сульфат-восстанавливающих и собственно метанобразующих бактерий, которые взаимосвязанно расщепляют органический субстрат до С0₂ и СН₄. В качестве субстрата используют декантированную ацетоно-бутиловую барду, содержащую 2,0—2,5% сухих веществ. Брожение проходит при 55—57 °С в нестерильной культуре в две фазы: на первой образуются жирные кислоты и метан, на второй — метан, углекислота и витамин В₁₂. Длительность процесса в одном аппарате составляет 2,5—3,5 суток, в двух (последовательно) — 2—2,5 суток. Концентрация витамина в барде достигает 850 мкг/л. Параллельно в значительных количествах образуется газ (65% метана и 30% углекислоты). Барда имеет слабощелочную реакцию. Для стабилизации витамина ее подкисляют соляной или фосфорной кислотой, затем в выпарном аппарате сгущают до 20% содержания сухих веществ и высушивают в распылительной сушилке. Содержание В₁₂ в сухом препарате составляет до 100 мкг/г.

Получение витамина В₂. Название витамина В₂ — рибофлавин — происходит от сахара рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде многоатомного спирта D-рибита. Он широко распространен в природе и в значительных количествах синтезируется растениями, дрожжами, грибами, бактериями.

Животные, не синтезирующие этот витамин, должны получать его в составе комбикормов, поскольку при его дефиците в организме нарушаются процессы белкового обмена, замедляется рост. Препараты рибофлавина используют в медицине для лечения ряда заболеваний, а в животноводстве — в качестве добавки в корма. Микроорганизмы синтезируют рибофлавин и две его коферментные формы — ФАД иФМН.

Продуцентами витамина В₂ являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes, Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, C. flaveri), микроскопические (Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii) и плесневые (Aspergillus niger) грибы.

Промышленное получение рибофлавина осуществляют химическим, микробиологическим и комбинированным синтезом. В последнем случае синтезированная микроорганизмами рибоза химически трансформируется в В₂.

Для медицинских целей микробиологический рибофлавин получают на основе гриба Aspergillus. Для высоких выходов витамина (до 7 г/л) используют усовершенствованные штаммы и оптимизированные среды, содержащие (в процентах): кукурузный экстракт — 2,25; пептон — 3,5; соевое масло — 4,5 и стимуляторы (пептоны, глицин). Используют активный инокулят, которым засевают стерильную среду. Ферментацию проводят в течение семи суток при 28 °C и хорошей аэрации. Исходный pH составляет около 7,0, в ходе ферментации в связи с выделением кислот среда подкисляется до pH 4,0—4,5. После использования углеродного субстрата продуцент начинает утилизировать кислоты, pH повышается, и затем начинается образование витамина В₂. При этом кристаллы рибофлавина накапливаются в гифах и вне мицелия. На постферментационной стадии для выделения витамина мицелий нагревают в течение 1 ч при 120 °C.

В ряде стран для получения кормовых препаратов витамина В₂ используют достаточно простой способ, основанный на выращивании микроскопического гриба Eremothecium ashbyii в глубинной культуре в течение 80—84 ч при 28—30 °С на среде с глюкозой или мальтозой (2,5%), источником азота в виде NH₄N0₃ и карбоксидом кальция (0,5%). Выход рибофлавина составляет 1250 мкг/мл. Культуральная жидкость концентрируется в вакуумном испарителе до содержания сухих веществ 30—40% и высушивается в распылительной сушилке. Товарная форма продукта — порошок с содержанием рибофлавина не менее 10 мг/г и 20% сырого протеина. В препарате присутствуют также никотиновая кислота и витамины В_1з В₃, В₆ и В₁₂. При использовании штамма Bacillus subtilis, полученного генно-инженерным методом, выход рибофлавина составлял 4 г/л за 35 суток ферментации.

Получение эргостерина. Эргостерин (эргоста-5,7,22-триен-3(3-ол) является исходным продуктом при производстве витамина D₂ и кормовых препаратов дрожжей, обогащенных этим витамином. Витамин D₂ (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетом эргостерина, который в значительных количествах синтезируют бурые водоросли, дрожжи, плесневые грибы. Наиболее активные продуценты эргостерина — Saccharomyces, Rhodotoryla, Candida.

В промышленных масштабах эргостерин образуется при культивировании дрожжей и мицелиальных грибов на средах, содержащих избыток сахаров и недостаток азота, при высокой температуре и хорошей аэрации. Более интенсивно эргостерин образуют дрожжи рода Candida на средах с углеводородами. Кристаллический препарат витамина D₂ получают при культивировании плесневых грибов (Penicillium, Aspergillus).

Для получения кормовых препаратов проводят облучение суспензии или сухих дрожжей (Candida). Так, тонкий слой 5%-й суспензии дрожжей облучают ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280— 300 нм.

Для получения кристаллического препарата витамина дрожжи или грибной мицелий подвергают кислотному гидролизу при 110 °C. Витамин D₂ экстрагируют спиртом, фильтруют, фильтрат упаривают и несколько раз промывают спиртом. Спиртовой экстракт сгущают до 50%-й концентрации сухих веществ, омыляют щелочью. Образовавшиеся кристаллы витамина очищают перекристаллизацией и сушат в эфире, отгоняя последний. Кристаллический осадок растворяют в масле. Препарат используют в медицинских целях. Эргостерин служит также исходным продуктом для получения ряда стероидных гормонов, пищевых и лекарственных препаратов.