Методики дослідження панкреатичних острівців
Для цитохімічного визначення цинку шматочки підшлункової залози фіксували протягом 12 годин в холодному ацетоні (+40С) та витримували по 15 хвилин в 2-х порціях ксилолу. Потім промивали шматочки протягом 30 хвилин в суміші 50% парафіну та 50% ксилолу при температурі 370С. Із такої суміші (каши) шматочки переносили в один, потім в другий рідкий парафін. Тривалість інфільтрування в кожному парафіні… Читати ще >
Методики дослідження панкреатичних острівців (реферат, курсова, диплом, контрольна)
Цитохімічна реакція 8-ТСХ у панкреатичних клітинах В
Для цитохімічного визначення цинку шматочки підшлункової залози фіксували протягом 12 годин в холодному ацетоні (+40С) та витримували по 15 хвилин в 2-х порціях ксилолу. Потім промивали шматочки протягом 30 хвилин в суміші 50% парафіну та 50% ксилолу при температурі 370С. Із такої суміші (каши) шматочки переносили в один, потім в другий рідкий парафін. Тривалість інфільтрування в кожному парафіні - 1,5 години при 560С. Потім шматочки заливали в парафін [20−25].
Із приготовлених блоків підшлункової залози готували парафінові зрізи товщиною 5−10 мкм. Зрізи фарбували 0,01% ацетоновим розчином 8-ТСХ після попереднього депарафінування. Парафінові зрізи переносили прямо з ножа на предметне скло, яке вкрите шаром яєчного білка. Для цього за допомогою скляної палички на предметне скло наносили тонким шаром яєчний білок. Останній прожигали над полум’ям спиртівки. На шар яєчного білка поміщали парафіновий зріз і прижимали до предметного скла. Така процедура забезпечувала найкращу фіксацію на предметному склі парафінового зрізу. Виключення розплавлення зрізу в теплій воді перед виловлюванням його на предметне скло покращує відтворюваність результатів [22,24,26].
Депарафінування зрізів проводили в такий спосіб: зрізи витримували в двох частинах ксилолу (по 3 хвилини в кожній), двох частинах ацетону (по 3 хвилини в кожній). Зрізи, які вилучають із другого ацетона стають на повітрі білісуватими в результаті того, що ацетон випаровується. На поверхню зрізу наносили за допомогою піпетки 0,01% ацетоновий розчин 8-ТСХ. Через 1 хвилину промивали дистильованою водою, занурювали в гліцерин і розглядали під люмінесцентним мікроскопом. Для збудження люмінесценції застосовували світлофільтр ФС-1, а у якості захисного (окулярного) використали світлофільтр зі скла ЖС-18. На препаратах у цитоплазмі панкреатичних клітин В виявлялася зернистість, яка люмінесціювала жовто-зеленим світлом [24−28].
Для доказу специфічності цитохімічної реакції 8-ТСХ із цинком на де парафіновані зрізи наносили 0,1 М розчин ЕДТОК і розчин ДЕДТКН або 0,1 М розчин ДЕДТКН. При послідовній обробці зрізів 8-ТСХ, у них не виявлялося люмінесцентної реакції [20,24,28].
Пояснюється це тим, що ЕДТОК і ДЕДТКН утворюють із цинком нефлуоресцуючий комплекс. Обробка ЕДТОК і ДЕДТКН зрізів із люмінесцентною реакцією 8-ТСХ призводила до гасіння цієї реакції внаслідок витиснення 8-ТСХ із комплексу з цинком [29].
Після обробки з хлороформом зрізів, позитивною реакцією 8-ТСХ повторне фарбування острівцевих клітин цим реагентом не вийшло. Це явище пов’язано із екстракцією 8-ТСХ-цинкового комплексу, який добре розчиняється у хлороформі, із клітин [30].