Азотобактер у ґрунтах лісостепу України: поширення і біологічна активність

Уманський національний університет садівництва ВАГА Лілія Іванівна УДК 631.461.5:579.26: 633.11

Азотобактер у ґрунтах лісостепу України: поширення і біологічна активність

автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

03.00.07 — мікробіологія Умань — 2010

Дисертацією є рукопис Робота виконана в лабораторії екології мікроорганізмів Інституту агроекології

Національної академії аграрних наук України.

Науковий керівник — доктор сільськогосподарських наук, професор Шерстобоєва Олена Володимирівна,

Інститут агроекології НААНУ, завідувач відділу еколого-біологічних досліджень.

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Патика Микола Володимирович, Навчально-науковий інститут охорони природи і біотехнологій Національного університету біоресурсів і

природокористування України, завідувач кафедри біології ґрунтів і мікроорганізмів;

кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Мельничук Тетяна Миколаївна Південний філіал Інституту сільськогосподарської мікробіології НААНУ, завідувач лабораторії

біологічного азоту і фосфору, директор.

Захист відбудеться «20» травня 2010 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 74.844.02 в Уманському національному університеті садівництва за адресою: вул. Інститутська, 1, м. Умань, Черкаська обл. Україна, 20 305, навчальний корпус № 4, аудиторія 178.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Уманського національного університету садівництва за адресою: вул. Інститутська, 1, м. Умань, Черкаська обл., 20 305.

Автореферат розісланий «16» квітня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої радиВ.П. Карпенко

Загальна характеристика роботи азотобактер ґрунт лісостеп Актуальність теми. У ХХІ століття людство ввійшло з низкою екологічних проблем, дедалі сильнішим стає антропогенний тиск на навколишнє природне середовище, спостерігається деградація ґрунтів. Щорічно ґрунти України втрачають понад 20 млн т гумусу. Для відтворення їх родючості з року в рік слід вносити понад 2,2 млн т азоту, що становить 50−60 кг/га, тоді як вноситься лише 15−20% від потреби. Така ж ситуація і з іншими добривами (Сайко В.Ф., 2003).

Функція зв’язування молекулярного азоту атмосфери широко розвинена в світі мікробів, яким належить стосовно цього визначна біогеоценотична роль. Саме вони поповнюють втрати азоту в ґрунтовому шарі і підтримують поживні властивості лісових і лугових земель, які незмінно дають врожай без удобрень.

Високородючі ґрунти України еволюційно сформувались, в основному, під степовими фітоценозами, в яких найважливішу роль азотопостачальників відіграють бактерії, що фіксують азот атмосфери за вільного існування та в асоціативній взаємодії з небобовими рослинами. Найпродуктивніше цей процес здійснюється бактеріями роду Azotobacter (Умаров М.М., 1984).

Останніми роками відзначається негативний вплив деградаційних процесів, що відбуваються у ґрунті за умов ресурсодефіцитного забезпечення сільськогосподарського виробництва, на функціонування азотобактера у ґрунтах аграрних екосистем (Патика В.П., 1993; 2003). Поряд із цим, моніторингові дослідження з питань розповсюдження азотобактера у ґрунтах колишнього СРСР проводились ще в 30-х роках ХХ ст., але на території України було охарактеризовано тільки солонці Чернігівської області (Сушкіна Н.Н., 1949). Майже не досліджено вплив умов едафотопу на прояв агрономічно цінних властивостей цих бактерій.

Тому актуальним є проведення систематичного дослідження розповсюдження бактерій р. Azotobacter у ґрунтах природних і аграрних екосистем, зокрема Лісостепу України, а також виділення, ідентифікація та вивчення агрономічно цінних властивостей домінуючих штамів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано згідно з тематичними планами Інституту агроекології НААНУ НТП «Агроекологія», завдання — «Розробити науково-методичні засади створення поліфункціональних мікробних препаратів для екологобезпечних інтегрованих систем захисту і удобрення рослин» (ДР № 0106U004044).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було встановлення розповсюдження бактерій р. Azotobacter у ґрунтах Лісостепу України та виділення штамів з комплексом агрономічно цінних властивостей, перспективних для застосування в сільському господарстві.

Для досягнення мети потрібно було виконувати такі завдання:

· встановити поширення бактерій р. Azotobacter у необроблених ґрунтах та ґрунтах стаціонарних дослідів наукових установ, розташованих у різних областях Лісостепу України;

· визначити вплив типу ґрунту, агрокультури, системи удобрення та вапнування на чисельність азотобактера;

· виділити штами бактерій р. Azotobacter з досліджених едафотопів;

· визначити продуктивність азотфіксації виділених штамів;

· з’ясувати здатність виділених штамів азотобактера до продукування речовин антибіотичної та фітогормональної дії;

· встановити здатність штамів азотобактера до мобілізації мінеральних важкорозчинних фосфатів;

· проаналізувати вплив найактивнішого штаму азотобактера на розвиток та продуктивність пшениці озимої.

Об'єкт дослідження. Бактерії р. Azotobacter у ґрунтах Лісостепу України.

Предмет дослідження. Поширення і біологічна активність штамів бактерій р. Azotobacter в агроекосистемах Лісостепу України та виявлення штамів з комплексом агрономічно цінних властивостей.

Методи дослідження:

· лабораторні - визначення чисельності та властивостей бактерій р. Azotobacter у різних едафотопах, встановлення нітрогеназної, фосформобілізивної, рістрегулювальної та антагоністичної активності виділених штамів;

· вегетаційний та польовий — відбір зразків і визначення впливу найактивнішого штаму азотобактера на розвиток та врожайність пшениці озимої;

· статистичний метод — математичний аналіз результатів експериментів.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено систематичне комплексне дослідження поширення, різноманіття і біологічної активності бактерій р. Azotobacter у ґрунтах, що не обробляються, та ґрунтах сільськогосподарського землекористування Лісостепу України.

Поглиблено уявлення про залежність продуктивності азотфіксації, продукції речовин фітогормональної та антибіотичної дії, здатності до мобілізації важкорозчинних мінеральних фосфатів штамів бактерій р. Azotobacter від умов едафотопу. Вперше показано, що штами, які містять у культуральній рідині речовини, що з високою активністю стимулюють ріст рослин, переважно виділяються як домінанти із ґрунту агроекосистем, де застосовуються мінеральні добрива. Штами з високою продуктивністю азотфіксації переважно виділяються із ґрунту агроекосистем контрольних варіантів без удобрення та варіантів, де застосовуються органічні добрива або мінеральні у дозі, що не перевищує 60 кг/га азоту.

Показано видову різноманітність домінуючих бактерій р. Azotobacter у ґрунтах Лісостепу. Абсолютним домінантом у всіх досліджених ґрунтах є A. chroococcum, у чорноземі типовому — другим за розповсюдженням є A. vinelandii, а в сірому лісовому ґрунті серед домінуючих виявили й A. beijerinckii.

Із чорнозему типового виділено штам A. vinelandii 12 М, який має високу активність азотфіксації, фосфатмобілізації, продукування речовин фітогормональної та антифунгальної дії.

Практичне значення одержаних результатів. Одержано штам Azotobacter vinelandii 12 М, який має комплекс агрономічно цінних властивостей, завдяки чому позитивно впливає на розвиток рослин, продуктивність пшениці озимої та якість одержаного насіння і може бути основою для створення біопрепаратів поліфункціональної дії.

Показано, що вапнування кислих ґрунтів нівелює інгібувальну дію мінеральних добрив на розвиток та біологічну активність азотобактера в ґрунті під посівом пшениці озимої, що забезпечує додаткове підвищення її врожайності.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка брала участь у розробці програми досліджень, самостійно провела всі мікробіологічні аналізи та лабораторні експерименти, вегетаційні та польові досліди. Одержані результати узагальнила у друкованих наукових працях, сформулювала висновки, підготувала пропозиції виробництву. Під час експедиційних виїздів відбирала зразки ґрунту в різних варіантах стаціонарних дослідів наукових установ, розташованих у різних областях Лісостепу України, керівникам і співробітникам яких висловлюємо щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації представлено на наукових конференціях: науково-практичній конференції молодих вчених «Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва» (22−24 травня 2007 р., м. Київ); IV Міжнародній конференції молодих вчених, аспірантів і студентів «Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки» (2008 р., м. Владикавказ, Росія); Всеукраїнській науковій конференції молодих вчених (2008 р., м. Умань); науковій конференції, присвяченій 40-річчю Південної дослідної станції «Почвенная микробиология и стабильное развитие агроэкосистем» (26−29 червня 2008 р., с. Гвардійське, АР Крим); ІІ науково-практичній конференції молодих вчених «Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва» (9−11 вересня 2008 р., м. Київ); ХІІ з'їзді Товариства мікробіологів України ім. С. М. Виноградського (25−30 травня 2009 р., м. Ужгород); ІІІ науково-практичній конференції молодих вчених «Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва «(22−25 вересня 2009 р., м. Київ); І Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених «Перспективні напрями розвитку галузей АПК і підвищення ефективності наукового забезпечення агропромислового виробництва» (24−25 вересня 2009 р., м. Тернопіль); ІV науковій конференції молодих вчених «Мікробіологія в сучасному сільськогосподарському виробництві» (29−30 вересня 2009 р., м. Чернігів).

Публікації. Результати досліджень з теми дисертації викладено у 17 наукових працях, серед них 7 статей у фахових виданнях, 9 тез доповідей, 1 патент.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 115 сторінках основного машинописного тексту, ілюстровано 31 таблицею, 21 рисунком. Дисертація складається: із вступу; 5-ти розділів, з яких 3 є експериментальною частиною роботи; загальних висновків; пропозицій виробництву; додатків. Список використаних джерел містить 160 найменувань, з них 40 латиницею.

основний зміст роботи Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено сучасний стан досліджень з питання біології бактерій р. Azotobacter, їх взаємодії з рослинами в природних та аграрних фітоценозах, а також ефективності використання агрономічно цінних властивостей мікроорганізму в сільському господарстві.

На основі аналізу сучасної вітчизняної та зарубіжної літератур з питань поширення та біологічної активності штамів азотобактера в різних едафотопах доведено актуальність теми дисертаційної роботи.

Об'єкти, методи та умови проведення досліджень. Систематичні спостереження за чисельністю та біологічною активністю бактерій р. Azotobacter у ґрунтах природних екосистем та ґрунтах стаціонарних дослідів наукових установ, що розташовані у різних регіонах Лісостепу України, проводили впродовж 2006;2009 рр., аналізуючи зразки ґрунту в лабораторії екології мікроорганізмів відділу еколого-біологічних досліджень Інституту агроекології НААНУ.

Зразки ґрунту відбирали на 10 стаціонарних дослідах наукових установ Національної академії аграрних наук України та Міністерства освіти і науки України, розташованих у 9 областях. При виборі стаціонарних дослідів для проведення мікробіологічних досліджень враховували типовість ґрунту обраного регіону.

Ґрунти у стаціонарних дослідах є такі: Миронівського інституту пшениці ім. В. М. Ремесла НААНУ в Київській обл. — чорнозем типовий, рН 5,6; Інституту агроекології НААНУ в Київській обл. — сірий лісовий, рН 4,6; Уманського національного університету садівництва в Черкаській обл. — чорнозем опідзолений звичайний, рН 5,2; Хмельницької ДСГДС НААНУ в Хмельницькій обл. — чорнозем опідзолений, рН 6,2; Рівненської ДСГДС НААНУ в Рівненській обл. — темно-сірий опідзолений, рН 5,8; Полтавського ІАПВ НААНУ в Полтавській обл. — чорнозем типовий, рН 6,4; Тернопільського ІАПВ НААНУ в Тернопільській обл. — чорнозем типовий, рН 5,7; Інституту кормів НААНУ у Вінницькій обл. — сірий лісовий опідзолений, pH 5,0; Харківського державного аграрного університету — чорнозем типовий, рН 7,0; Інституту землеробства і тваринництва західного регіону НААНУ у Львівській обл. — темно-сірий опідзолений, рН 4,6.

Для визначення чисельності азотобактера в різних типах ґрунтів, що не обробляються (перелоги та екотони), а також у ґрунті міжрядь та ризосфери сільськогосподарських рослин, відбирали зразки ґрунту у квітні на глибині 0−20 см за ДСТУ 17.4.02−84. Для вивчення впливу певних видів агрокультур на розвиток азотобактера зразки ґрунту ризосфери відбирали на контрольних ділянках, де посіви не удобрювались та не оброблялись пестицидами.

Динаміку чисельності азотобактера визначали в основних фазах розвитку пшениці озимої в ризосфері та міжряддях у стаціонарних дослідах Тернопільського ІАПВ НААНУ, де досліджується вплив вапнування на ефективність різних доз мінеральних добрив на продуктивність пшениці озимої сорту Подолянка, та Миронівського інституту пшениці ім. В. М. Ремесла НААНУ, де досліджується вплив мінеральної, органічної та органо-мінеральної систем удобрення на продуктивність пшениці озимої сорту Миронівська 67.

Мікробіологічні дослідження проводили загальноприйнятими методами (Методы почвенной микробиологии и биохимии за ред. Д. Г. Звягинцева, 1991): чисельність бактерій р. Azotobacter визначали методом аплікацій на поверхні агаризованого середовища Ешбі; прояв антагонізму штамів азотобактера до фітопатогенних мікроміцетів визначали за Єгоровим; продукцію речовин рістрегулювальної дії - за приростом коренів редису за методикою О.І. Берестецького; здатність штамів азотобактера мобілізувати важкорозчинні мінеральні фосфати — за утворенням навколо колоній азотобактера прозорої зони розчиненого трикальційфосфату на середовища Муромцева; нітрогеназну активність штамів азотобактера визначали методом ацетиленредукції (Hardy R., 1968). Залишок цукру в середовищі, після культивування штамів азотобактера, визначали за Бертраном (Гродзинский А.М., Гродзинский Д. М., 1973).

Визначення виду домінуючих штамів бактерій р. Azotobacter проводили традиційними методами за ідентифікаційними тест-ознаками (Определитель бактерий Берджи у 2-х тт., 1997).

Вплив метаболітів штамів азотобактера на ріст та нагромадження сухої маси рослин пшениці озимої сорту Миронівська 67 визначали у вегетаційному досліді. Рослини вирощували у посудинах ємністю 500 мл із 500 г ґрунту. Ґрунт — чорнозем типовий малогумусний середньосуглинковий, рН 5,8, вміст гумусу — 3,52% (за Тюріним), вміст Р2О5 за (Чириковим) — 107 мг/кг ґрунту, К2О (за Чириковим) — 90 мг/кг ґрунту, лужногідролізованого азоту (за Корнфілдом) — 144,7 мг/кг ґрунту. За еталон у дослід уведено варіант оброблення насіння препаратом Азотофіт на основі Azotobacter chroococcum, зареєстрований і дозволений для виробництва та використання в Україні. Інокуляційне навантаження 2−5 104 клітин азотобактера на 1 насінину. Висівали по три насінини у кожну посудину. Повторення — десятиразове.

Два польових досліди з визначення ефективності інокуляції насіння культурою нового штаму азотобактера на продуктивність пшениці озимої було проведено впродовж 2007;2009 рр. на двох різних типах ґрунтів у різних геокліматичних умовах за аналогічною схемою.

Перший — в Одеській області на базі ФГ «ТЄНОД», ґрунт — чорнозем південний, рН 6,9, вміст гумусу в орному шарі 2,2−3,3%, середня забезпеченість рухомими формами азоту складає 23−28 мг/кг ґрунту, рухомих форм фосфору — 50−61, калію — 50−58 мг/кг сухого ґрунту. Загальна площа досліду 15 га, облікова площа ділянки — 1 га, повторення триразове.

Другий — у Вінницькій області на базі ФГ «Еко-Гарант», ґрунт — сірий лісовий опідзолений, pH 5,5, вміст гумусу в орному шарі - 2,2%, рухомого азоту — 53 мг/кг ґрунту, рухомого фосфору — 281, обмінного калію — 152 мг/кг ґрунту. Загальна площа досліду 10 га, облікова площа ділянки — 1 га, повторення триразове.

В обох дослідах використовували пшеницю озиму сорту Поліська 90. Норма висіву — 5,5 млн схожих насінин на 1 га. Агротехніка вирощування пшениці озимої типова для виробничих умов регіону. Насіння дослідного варіанта обробляли 3-добовою культурою азотобактера, розведеною в 10 разів, інокуляційне навантаження становило 2−5 104 клітин на 1 насінину.

Для порівняння в схему дослідів увели варіант, в якому насіння обробляли хімічним протруйником Класік із стимуляційною дією на ріст рослин та вносили у ґрунт мінеральні добрива у дозі N60Р40К40.

Математичний аналіз одержаних результатів проводили за допомогою стандартних комп’ютерних програм Excel та Statistic, за коефіцієнтом Ст’юдента — в лабораторних дослідах і за коефіцієнтом Фішера — в польових (Доспехов Б.А., 1985; Царенко О. М., 2000).

Основні результати дослідження Поширення бактерій роду Azotobacter у ґрунтах Лісостепу України. Трирічні результати систематичного дослідження поширення бактерій р. Azotobacter у ґрунтах, які не обробляються, показали, що найвища чисельність азотобактера спостерігається в чорноземі типовому та темно-сірому опідзоленому ґрунтах, реакція ґрунтового розчину яких наближається до нейтральної. У цих же типах ґрунтів, але із рН нижче 5,5, лише 16−36% грудочок ґрунту містять азотобактер. Найнесприятливішими для розвитку азотобактера виявились опідзолені та сірі лісові ґрунти, рН яких нижче 5,0. У таких ґрунтах азотобактер не траплявся або виявлявся у дуже малій кількості (рис. 1а).

На рисунку 1б наведено дані, що демонструють максимальну кількість азотобактера, яку виявили у ґрунтах стаціонарних дослідів без врахування варіантів удобрення, виду агрокультури та агротехніки її вирощування. Більшість досліджених зразків ґрунту агрофітоценозів містять високу кількість цих бактерій, і тільки у ґрунтах з низьким рН, де не проводиться вапнування, їх кількість коливається від повної відсутності в темно-сірому опідзоленому з рН 4,6, до 32% грудочок, що обросли колонією азотобактера, у такому ж ґрунті, але з рН 5,8. У чорноземі опідзоленому з рН 5,0 у 50% грудочок ґрунту виявляється азотобактер.

Враховуючи, що однією серед основних культур країни є пшениця озима, в її ризосфері та ґрунті міжрядь вивчали динаміку чисельності бактерій р. Azotobacter у стаціонарних дослідах Миронівського інституту пшениці ім. В. М. Ремесла та Тернопільського ІАПВ НААНУ. Зразки ґрунту відбирали та аналізували у таких фазах: кущення рослин, двічі - в лютому та квітні, трубкування — в травні, колосіння — в червні та молочно-воскової стиглості - в липні.

Згідно наведених середніх даних за 3 роки досліджень (рис. 3) у ґрунті міжрядь на контрольних варіантах у зимовий період кількість ґрунтових грудочок, на яких утворились колонії азотобактера, становить лише 12%.

Найвища їх кількість у період кущення пшениці озимої - близько 32%, а в подальшому спостерігається зниження до 5−12%. На ділянках із внесенням 30 т/га гною розвиток азотобактера значно активніший. У зимовий період та у фазі трубкування всі грудочки ґрунту містять азотобактер, але до кінця вегетації їх кількість знижується, і тільки 65% ґрунтових грудочок обростає колоніями азотобактера. Значно інгібує розвиток азотобактера внесення мінеральних добрив, і в цьому випадку кількість, оброслих колонією азотобактера, ґрунтових грудочок коливається у межах 0−20% впродовж усього терміну досліджень. За удобрення 30 т/га гною у поєднанні з мінеральними добривами N60Р40К40 кількість азотобактера нижча, ніж за внесення тільки органічних добрив.

У ризосфері пшениці озимої кількість грудочок, що містять азотобактер, не досягає 100% у жодному з варіантів та періодів відбору зразків. Найбільша чисельність азотобактера спостерігається у фазі кущення пшениці озимої, і незалежно від варіантів удобрення. Загальні тенденції зміни чисельності за фазами розвитку рослин та варіантами удобрення аналогічні ґрунту міжрядь, але із значно меншою мірою вияву. Найбільша кількість колоній азотобактера утворюється на грудочках ґрунту ділянок, в які вносили під пшеницю озиму органічні добрива, і максимального значення — 94% вона досягає у фазі кущення.

Отже, азотобактер не проявляє ризосферного ефекту і його представників у міжряддях виявляється не менше або, навіть більше, ніж у ризосфері. Найбільша кількість азотобактера у ґрунті міжрядь та ризосфері пшениці озимої у фазі кущення, тоді ж найбільше проявляється залежність розвитку популяції азотобактера від варіантів удобрення рослин.

Аналогічні дослідження провели на стаціонарному досліді Тернопільського інституту АПВ з чорноземом типовим рН 5,7, де проводиться вапнування ґрунту. Внесення мінеральних добрив під посіви пшениці озимої інгібує розвиток азотобактера, особливо цей вплив відзначається при застосуванні високих доз мінеральних добрив N120Р120К120 (табл. 1).

Таблиця 1

Динаміка розвитку бактерій роду Azotobacter в агрофітоценозі пшениці озимої, середні дані 2007;2009 рр.

Тернопільський ІАПВ, чорнозем типовий, рН 5,7

Як свідчать наведені дані, пригнічення розвитку азотобактера внесенням мінеральних азотних добрив нівелюється вапнуванням і його чисельність значно зростає у ризосфері та ґрунті міжрядь.

Вапнування істотно впливає й на врожайність пшениці озимої. Якщо без вапнування за внесення мінеральних добрив по 120 кг/га урожай зерна пшениці збільшується на 0,64 т/га, ніж за внесення 60 кг/га, то на фоні вапнування — на 0,79 (табл. 2). І це, поряд із підвищенням чисельності азотобактера у вапнованому ґрунті, свідчить про походження додаткового азоту внаслідок активації біологічної азотфіксації. Цей висновок підтверджує ще один аргумент — з ґрунту варіантів вапнування виділили найактивніші в цьому досліді азотфіксуючі штами: А. сhroocоссum 13 Т — із ризосфери пшениці озимої, та А. сhroocоссum 12 Т — із ґрунту міжрядь.

Для визначення впливу виду рослин на розвиток азотобактера аналізували ґрунт ризосфери агрокультур на контрольних варіантах без удобрення та застосування пестицидів у всіх обстежуваних стаціонарних дослідах. Встановили, що вплив культур на азотобактер варіює у залежності від типу ґрунту, його рН, попередньої культури сівозміни тощо. Наприклад, у дослідах ТІ АПВ НААНУ азотобактер активно розвивається в кореневій зоні ячменю, пшениці озимої, що вирощується після гороху. Проте у ризосфері пшениці озимої після конюшини вже тільки 66% ґрунтових грудочок містять азотобактер.

Таблиця 2

Вплив добрив і вапнування на урожайність пшениці озимої, т/га Тернопільський ІАПВ, чорнозем типовий, рН 5,7

Така ж щільність азотобактера й у ризосфері буряка цукрового, кукурудзи та гороху. В посівах конюшини азотобактер виявляється лише в 43% грудочок ґрунту (рис. 4).

Властивості домінуючих бактерій родуAzotobacter, ізольованих із ґрунтів Лісостепу України. З усіх досліджених зразків ґрунту різних дослідів з різними агрокультурами виділяли домінуючі штами азотобактера та вивчали їх біологічну активність. Штами, що проявляли високу активність агрономічно цінних властивостей: азотфіксації, продукції речовин стимуляційної, антигрибної та фосформобілізивної дії, виділяли у чисту культуру та ідентифікували, до виду.

За даними К.І. Андреюк та ін. (1992) і В. П. Патики та ін. (1993, 2003) продуктивність азотфіксації активних штамів азотобактера, виділених із ґрунтів України, коливається у межах 8−14 мг N2/г засвоєних вуглеводів. Із зразків ґрунту, відібраних у різних агрофітоценозах Лісостепу, нами виділено 11 штамів азотобактера, продуктивність азотфіксації яких коливалась від 0,5 до 21,6 мг азоту на 1 г засвоєних вуглеводів (табл. 3).

У чорноземі опідзоленому із рН 6,2 на стаціонарному досліді Хмельницької ДСГДС продуктивність азотфіксації виділених штамів азотобактера була в межах 5,3−14,9 мг N2/г вуглеводів, і найвищим рівнем відрізнялись штами 5Х та 6Х, виділені із ґрунту контрольних варіантів вирощування рослин без внесення добрив.

Із темно-сірого опідзоленого ґрунту з рН 5,8 на стаціонарному досліді Рівненської ДСГДС виділено штами, які фіксували 1,9−9,1 мг N2/г вуглеводів. Найактивніший штам 3Р також виділено із контрольного варіанта досліду.

Штами, виділені із чорнозему типового з рН 5,7 стаціонарного досліду Тернопільського ІАПВ, фіксували 0,8−13,5 мг N2/г вуглеводів. Всі штами, виділені із ґрунту без внесення добрив, засвоювали близько 8 мг N2/г, а штам 13 Т із ґрунту з внесенням N60Р60К60 на фоні вапнування — 13,5 мг N2/г.

Штами азотобактера із чорнозему типового з рН 5,6 на дослідних ділянках стаціонарного досліду МІП НААНУ засвоювали 2,1−16,0 мг N2/г вуглеводів. Найактивніший штам 9 М виділено із ґрунту з внесенням 30 кг/га гною.

У чорноземі типовому із рН 6,4 стаціонарного досліду Полтавського АПВ штами засвоювали 1,9−21,6 мг N2/г. Також із ґрунту варіанта з органо-мінеральною системою удобрення був виділений найактивніший штам 5П.

Із чорнозему опідзоленого з рН 5,0 стаціонарного досліду УНУС штами засвоювали 2,3−8,2 мг N2/г вуглеводів. Найактивніший штам 18У виділено із ґрунту контрольного варіанта вирощування рослин без удобрення.

У чорноземі типовому з рН 5,0 стаціонарного досліду Вінницького ІК НААНУ продуктивність азотфіксації окремих штамів азотобактера досягала 16,9 мг N2/г вуглеводів. Вони були виділені із не удобреного ґрунту контрольних варіантів, а найактивніший 10В-2 — із варіанта удобрення: 15 т/га гною + N45Р60К60.

Отже, штами азотобактера, які здійснюють процес фіксації молекулярного азоту з найбільшою продуктивністю, виділено із ґрунтів з різним рівнем рН контрольних не удобрених варіантів або удобрених гноєм, а якщо мінеральними добривами, то в дозі не більше 60 кг/га д. р. азоту.

Метаболіти 6 штамів азотобактера, виділені із ґрунтів Лісостепу, містять речовини, які стимулюють ріст тест-культури понад 50%. Так, з чорнозему типового з рН 5,6 стаціонару МІП НААНУ, що не обробляється, виділено штам 1 М із рістстимуляційним ефектом 57,7%, а із ґрунту варіанту удобрення N60Р40К40 — штам 5 М з рістстимуляційним ефектом 96,2%.

Із чорнозему типового рН 5,7 стаціонарних дослідів ТІ АПВ активні штами 6 Т та 15 Т виділено із варіантів застосування N90Р90К90, які стимулювали ріст коренів відповідно на 74,2% та 80,6%. Найбільшу активність — 93,5% виявили у штамі 8 Т із ґрунту з внесенням N120Р120К120 (табл. 3).

Таблиця 3

Штами з найвищою біологічною активністю агрономічно цінних властивостей

Отже, штами азотобактера, метаболіти яких містять речовини, що стимулюють ріст рослин на 57−96%, виділено переважно із чорнозему типового з рН вище 5,5, найбільш збагаченого доступними для мікроорганізмів і рослин поживними елементами, зокрема за внесення мінеральних добрив.

Здатність до фунгістатичної та фосформобілізивної дії виявлено у різних видів бактерій р. Azotobacter, які були виділені із усіх типів ґрунтів з різним рівнем рН, різних агрофітоценозів та варіантів їх удобрення, отже, закономірностей їх розповсюдження не виявлено.

Ідентифікація штамів азотобактера з високою біологічною активністю агрономічно цінних властивостей показала, що абсолютним домінантом у ґрунтах агрофітоценозів є вид A. chroococcum, у чорноземі типовому — другим за розповсюдженням є A. vinelandii, а в сірому лісовому ґрунті серед домінуючих виявили й A. beijerinckii.

Високим рівнем біологічної активності всіх виявлених агрономічно цінних властивостей характеризується штам A. vinelandii 12 М, виділений із ризосфери пшениці озимої, вирощуваної на чорноземі типовому за органо-мінеральної системи удобрення.

Вплив штаму Azotobacter vinelandii 12 М на рослини пшениці озимої у вегетаційному та польових дослідах.

У вегетаційному досліді вивчали вплив інокуляції насіння культурою поліфункціонального штаму A. vinelandii 12 М на розвиток рослин пшениці озимої порівняно з еталоном — зареєстрованим препаратом Азотофіт (на основі А. сhroocоссum) та виділеним нами штамом А. сhroocоссum 13 Т, який має високі рівні продуктивності азотфіксації та рістстимуляції.

За інокуляції насіння штамами 12 М та 13 Т збільшується висота 15-денних рослин відповідно на 23,8% та 11,5% порівняно з контрольними не бактеризованими рослинами. Проте штам 12 М на 5,6% перевищує висоту рослин у варіанті з Азотофітом, а штам 13 Т поступається еталону на 6,7% (табл. 4).

Підвищення висоти рослин на ранніх етапах розвитку є підтвердженням наявності у метаболітах азотобактера речовин фітогормональної дії, адже покращення живлення рослин азотом не виявляється у перші 15 діб вегетації.

Суха маса 40-денних рослин, інокульованих штамами 12 М та 13 Т, була більшою відповідно на 34,2% та 20,1% порівняно з масою рослин у контролі.

Таблиця 4

Вплив інокуляції насіння культурами азотобактера на розвиток пшениці озимої сорту Миронівська 67 (вегетаційний дослід)

Проте суха маса рослин, бактеризованих штамом 12 М, на 5,3% була вища, а штамом 13 Т — нижча на 8,8% порівняно з масою рослин, насіння яких обробляли препаратом Азотофіт (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив інокуляції насіння A. vinelandii 12 М на розвиток рослин пшениці озимої сорту Миронівська 67 (вегетаційний дослід)

Отже, інокуляція насіння культурою штаму A. vinelandii 12 М найбільше сприяла інтенсифікації росту та нагромадженню сухої маси пшениці озимої.

У польових дослідах встановлено, що інокуляція насіння пшениці озимої сорту Поліська 90 культурою штаму A. vinelandii 12 М сприяє підвищенню її врожайності. У досліді, проведеному у Вінницькій області на сірому лісовому ґрунті з рН 5,5, урожайність пшениці озимої зростала на 6,8% порівняно з контролем. Проте у варіанті з використанням протруювача Класік та мінеральних добрив отримана врожайність пшениці озимої вища на 5,5% порівняно із варіантом застосування A. vinelandii 12 М (табл. 6).

В Одеській області на чорноземі південному з рН 6,9 інокуляція зерна пшениці озимої підвищувала урожайність культури на 13,0% порівняно з контролем. У варіанті з використанням хімічного протруювача Класік та мінеральних добрив врожайність пшениці озимої підвищувалась на 16,0%.

Поряд із цим, у зерні пшениці озимої з інокульованих рослин підвищується на 0,8% вміст клейковини порівняно з контролем.

У Вінницькій області у польовому досліді на сірому лісовому ґрунті з рН 5,5 економічний ефект застосування штаму A. vinelandii 12 М становив 310 грн/га.

Таблиця 6

Вплив інокуляції насіння A. vinelandii 12 М на урожайність пшениці озимої сорту Поліська 90

В Одеській області на чорноземі типовому з рН 6,9 економічний ефект застосування штаму A. vinelandii 12М — 368 грн/га.

ВИСНОВКИ Систематичне дослідження поширення та біологічної активності бактерій р. Azotobacter у ґрунтах природних та аграрних екосистем Лісостепу України дало змогу виявити закономірності поширення штамів із різною активністю агрономічно цінних властивостей та виділити штам Azotobacter vinelandii 12 М, що проявляє високу активність азотфіксації, продукції речовин фітогормональної, антифунгальної та фосформобілізивної дії і позитивно впливає на розвиток та врожайність пшениці озимої.

1. У ґрунтах агроландшафтів, що не обробляються (перелоги та екотони), найвища кількість бактерій р. Azotobacter виявлена в чорноземі типовому та темно-сірому опідзоленому, кислотність яких наближається до нейтральної, при рН ґрунту нижче 5,5 їх кількість зменшується у 3−4 рази, при рН нижче 5,0 азотобактер не виявляється.

2. Бактерії р. Azotobacter не проявляють ризосферного ефекту у посівах пшениці озимої - у ґрунті міжрядь їх не менше, ніж у ризосфері. Підвищення чисельності бактерій р. Azotobacter у ґрунті відбувається переважно навесні у фазі кущення пшениці озимої, крім варіантів удобрення її підвищеними дозами мінеральних добрив. У цих варіантах максимум розвитку азотобактера спостерігається у період колосіння та дозрівання зерна.

3. Внесення мінеральних добрив у дозах вище 60 кг/га д.р. пригнічує розвиток азотобактера в ґрунті, але вапнування сприяє його розвитку та нівелює інгібувальну дію високих доз мінеральних добрив, підвищує урожайність пшениці озимої порівняно з варіантами без вапнування на 5,6−7,5%, залежно від застосованої дози мінеральних добрив.

4. Азотфіксуючі штами азотобактера виділено із ризосфери та міжрядь різних рослин, що вирощуються на різних типах ґрунтів у різних кліматичних умовах зони Лісостепу України. Але найпродуктивніші виділили тільки із контрольних (не удобрених) варіантів, або удобрених гноєм або гноєм з добавкою мінеральних добрив, але не більше 60 кг/га.

5. Найактивніші штами-продуценти рістстимуляційних речовин виділено із ґрунту, найбільш збагаченого доступними для мікроорганізмів і рослин поживними елементами, зокрема за внесення мінеральних добрив у дозах 60−120 кг/га.

6. Штами бактерій р. Azotobacter, що мають фунгістатичну та фосформобілізивну здатність, виділені із усіх типів ґрунтів з різним рН, різних агрофітоценозів та варіантів їх удобрення, отже, закономірностей їх розповсюдження не виявлено.

7. У ґрунтах Лісостепу абсолютним домінантом є вид Azotobacter chroococcum, у чорноземі типовому — другим за розповсюдженням є Azotobacter vinelandii, а в сірому лісовому ґрунті серед домінуючих виявлено й Azotobacter beijerinckii.

8. Із чорнозему типового виділено штам A. vinelandii 12 М, який має високу продуктивність азотфіксації, активно продукує речовини фітогормональної дії, здатний мобілізувати важкорозчинні фосфати та пригнічувати ріст фітопатогенних грибів.

9. Оброблення насіння пшениці озимої штамом A. vinelandii 12 М до сівби сприяє накопиченню сухої фітомаси пшениці озимої на 34%, підвищенню урожайності на 6,8−13,0% та підвищує вміст клейковини у зерні на 0,8%.

Пропозиції виробництву Для стимуляції розвитку рослин пшениці озимої, підвищення її урожайності і якості зерна пропонується оброблення насіння до сівби новим штамом Azotobacter vinelandii 12 М, який має комплекс агрономічно цінних властивостей, а саме, високий рівень продуктивності азотфіксації, продукування речовин стимуляційної, фосформобілізивної та антигрибної дії. Цей штам може бути використаний для створення біопрепаратів поліфункціональної дії.

Для додаткового підвищення урожайності пшениці озимої та збільшення частки біологічного азоту в урожаї рекомендовано вапнування кислих ґрунтів, що значно активізує діяльність азотобактера, нівелюючи інгібувальну дію мінеральних азотних добрив на його розвиток та активність.

Список основних наукових праць, опублікованих за темою дисертації

Статті у наукових фахових виданнях

1. Федак Л.І. Бактерії роду Azotobacter в антропогенно трансформованих ґрунтах зони Лісостепу України / Л.І. Федак // Агроекологічний журнал. — 2008. — червень. — С. 240 — 243.

2. Білявський Ю.В. Біорізноманіття природної екосистеми / Ю.В. Білявський, Р. О. Вусатий, О.В. Шерстобоєва, Л.І. Федак // Збірник наукових праць Уманського державного аграрного університету. — 2008. — С. 211 — 217. (участь у зборі експериментальних даних, узагальненні результатів, написанні статті).

3. Білявський Ю.В. «Полтавська цілина» — унікальна природна екосистема / Ю.В. Білявський, Р. О. Вусатий, О.В. Шерстобоєва, Л.І. Федак // Агроекологічний журнал. — № 4. — 2008. — С. 70 — 74. (участь у зборі експериментальних даних, узагальненні результатів, написанні статті).

4. Шерстобоева Е. В. Биоиндикация экологического состояния почв / Е. В. Шерстобоева, Я. В. Чабанюк, Л. И. Федак // Сільськогосподарська мікробіологія. — 2008. — № 4. — С. 46 — 53. (взято участь у плануванні та постановці експериментів, написанні статті).

5. Федак Л.І. Азотобактер в агрофітоценозі пшениці озимої / Л.І. Федак // Агроекологічний журнал. — 2009. — № 3. — С. 93 — 94.

6. Шерстобоєва О.В. Поліфункціональна активність азотобактера в ґрунтах Лісостепу України / О.В. Шерстобоєва, Л.І. Федак // Агроекологічний журнал. — 2009. — червень. — С. 351 — 354. (дисертанту належить планування та проведення аналізів, написання статті).

7. Шерстобоєва О.В. Екологія бактерій роду Azotobaсter в агрофітоценозі пшениці озимої за впливу різних агрозаходів / О.В. Шерстобоєва, Л.І. Федак, Я. В. Чабанюк, С.І. Ольховецький // Таврійський науковий вісник. — 2009. — Вип. 67. — С. 137 — 142. (збір експериментальних даних, написання статті).

Патенти

8. Пат. 40 255 України, МПК A 01 G 7/00. Застосування біоцидного полімеру полімексаметилгуанідину гідрохлориду як стерилізатора рослинного матеріалу / Чабанюк Я. В., Бунас А. А., Опришко Н. О., Федак Л.І.; заявник і патентовласник Інститут агроекології УААН. — № u200813675; заявл. 26.11.08; опубл. 25.03.09, Бюл. № 6.

Матеріали та тези доповідей з'їздів, конференцій

9. Федак Л.І. Вплив антропогенних чинників на чисельність азотобактера в чорноземному ґрунті / Л.І. Федак: матеріали науково-практичної конференції молодих вчених ["Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва"], (Київ, 22−24 вересня 2007 р.). — Київ. — 2007. — С. — 57.

10. Федак Л.І. Azotobacter chroococcum у ґрунтах агроекосистем Лісостепової зони України / Л.І. Федак: матеріали Всеукраїнської наукової конференції молодих учених, (Умань, 21−22 лютого 2008 р.) / Міністерство аграрної політики України, Уманський державний агарний університет. — Умань. — 2008. — Ч. 1. — С. 64 — 65.

11. Федак Л.І. Вплив едафічних умов на розвиток азотобактера / Л.І. Федак: матеріали ІІ науково-практичної конференції молодих вчених ["Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва"], (Київ, 9−11 вересня 2008 р.). — Київ. — 2008. — С. 65 — 66.

12. Чабанюк Я. В. Препараты для экологически безопасных технологий выращивания сельскохозяйственных культур / Я. В. Чабанюк, В. В. Чайковская, Л. И. Федак, Н. А. Опрышко: материалы IV Международной конф. молодых ученых, аспирантов и студентов ["Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки"], (Россия, г. Владикавказ, 2008 г.) / М-во сельского хозяйства РФ, Горский госагроуниверситет — Владикавказ, 2008. — С. 141 — 142.

13. Федак Л.І Закономірності поширення бактерій роду Azotobacter в ґрунтах агроекосистем / Л.І. Федак: матеріали наукової конференції, присвяченої 40-річчю Південної дослідної станції ["Почвенная микробилогия и стабильное развитие агроэкосистем"], (АР Крим, 26−29 червня 2008 р.). — Симферополь. — 2008.

14. Шерстобоєва О.В. Активність бактерій роду Azotobacter в антропогенно змінених ґрунтах України / О.В. Шерстобоєва, Л.І. Федак: матеріали ХІІ з'їзду Товариства мікробіологів України ім. С. М. Виноградського, (Ужгород, 25−30 травня 2009 р.). — Ужгород. — 2009. — С. 348.

15. Федак Л.І. Різноманітність штамів азотобактера із ризосфери пшениці озимої / Л.І. Федак: матеріали ІІІ науково-практичної конференції молодих вчених ["Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва"], (Київ, 22−25 вересня 2009 р.). — Київ. — 2009. — С. 82 — 83.

16. Чайковська В. В. Активізація рослинно-мікробних взаємодій в кореневій зоні рослин / В. В. Чайковська, Н.І. Мартинюк, Л.І. Федак, Т. М. Коваленко: матеріали І Всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених ["Перспективні напрями розвитку галузей АПК і підвищення ефективності наукового забезпечення агропромислового виробництва"], (Тернопіль, 24−25 вересня 2009 р.). — Тернопіль. — 2009. — С. 84 — 85.

17. Федак Л.І. Поліфункціональна активність бактерій роду Azotobacter в ризосфері пшениці озимої / Л.І. Федак: матеріали ІV наукової конференції молодих вчених ["Мікробіологія в сучасному сільськогосподарському виробництв"] (Чернігів, 29−30 вересня 2009 р.). — Чернігів. — 2009. — С. 77 — 78.

Анотації

Вага Л.І. Азотобактер у ґрунтах Лісостепу України: поширення і біологічна активність. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.07 — мікробіологія. — Уманський національний університет садівництва, Умань, 2010.

Дисертаційну роботу присвячено дослідженню поширення та біологічної активності бактерій роду Azotobacter у ґрунтах Лісостепу України, а також виділенню найактивніших штамів та вивченню їх впливу на рослини пшениці озимої.

Проведені систематичні спостереження за чисельністю та активністю бактерій р. Azotobacter у ґрунтах агроекосистем Лісостепу України показали, що поширення та біологічна активність азотобактера залежить від умов едафотопу — типу ґрунту, його кислотності та застосованих при вирощуванні рослин агрозаходів. Встановлено, що абсолютним домінантом у ґрунтах Лісостепу України є вид Azotobacter chroococcum, у чорноземі типовому — другим за розповсюдженням є Azotobacter vinelandii, а в сірому лісному ґрунті серед домінуючих з’являється й Azotobacter beijerinckii.

Із чорнозему типового виділено новий штам A. vinelandii 12 М, що має комплекс агрономічно цінних властивостей, характеризується високим рівнем продуктивності азотфіксації, стимуляції росту рослин, мобілізує важкорозчинні фосфати ґрунту, проявляє антагонізм щодо фітопатогенних грибів. У вегетаційному та польових дослідах, проведених на двох типах ґрунтів у різних регіонах, показано, що інокуляція насіння пшениці озимої A. vinelandii 12 М стимулює ріст рослин, накопичення сухої фітомаси, підвищує урожайність пшениці озимої на 7−13% та вміст клейковини у зерні на 0,8%.

Ключові слова: азотобактер, азотфіксація, фосфатмобілізація, рістстимуляція, антагонізм, урожайність пшениці озимої.

Вага Л. И. Азотобактер в почвах Лесостепи Украины: распространение и биологическая активность. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.07 — микробиология. — Уманский национальный университет садоводства, Умань, 2010. — Рукопись.

Диссертационная работа посвящена изучению распространения и биологической активности бактерий рода Azotobacter в почвах Лесостепи Украины и выделению наиболее активных штаммов, которые могут влиять на урожайность пшеницы озимой.

Систематические наблюдения за численностью и активностью азотобактера в почвах агроэкосистем Лесостепи Украины показали, что его численность и биологическая активность зависят от условий эдафотопа его существования — типа почвы, ее кислотности и агроприемов, использованных при выращивании растений. Установлено, что абсолютным доминантом в почвах Лесостепи Украины является вид A. chroococcum, вторым по частоте встречаемости в черноземе типичном является A. vinelandii, а в серой лесной почве среди доминирующих появляется и A. beijerinckii.

Изучение динамики развития бактерий р. Azotobacter в междурядьях и ризосфере пшеницы озимой при разных системах удобрения показало отсутствие ризосферного эффекта, и в междурядьях представителей этого рода не меньше, чем в ризосфере. Самое активное развитие азотобактера в корневой зоне растений и междурядьях происходит весной в фазе кущения растений. Отмечено снижение не только функциональной активности, но и численности в вариантах с применением разных доз минеральных удобрений. Однако, органические удобрения и их совместное применение с невысокими дозами минеральных удобрений позитивно влияют на его развитие и активность.

Известкование слабокислых почв нивелирует ингибирующее влияние минеральных удобрений на активность азотобактера и существенно повышает урожайность пшеницы озимой.

Из всех образцов почвы выделены штаммы азотобактера и изучены их свойства: продуктивность азотфиксации, способность продуцировать вещества стимулирующие рост растений, трансформировать труднорастворимые фосфаты почвы в доступные растениям формы и ингибировать рост фитопатогенных грибов. Показано, что штаммы-продуценты веществ с высокой стимулирующей рост растений активностью, преимущественно функционируют в почве агроэкосистем, где применяются минеральные удобрения. Штаммы с высоким уровнем продуктивности азотфиксации обитают в почве без внесения удобрений или в почве, в которую вносятся органические удобрения и минеральные удобрения, но в дозе не больше 60 кг/га азота.

Из чернозема типичного выделен новый штамм A. vinelandii 12 М, который имеет комплекс агрономически ценных свойств и характеризуется высоким уровнем продуктивности азотфиксации, стимуляции росту растений, мобилизации труднорастворимых фосфатов почвы, угнетения развития фитопатогенных грибов.

В вегетационном и полевых опытах, проведенных на двух типах почв в разных регионах, инокуляция семян пшеницы озимой штаммом A. vinelandii 12 М стимулировала рост растений, увеличивала накопление сухого вещества в фитомассе, способствовала повышению урожайности культуры на 7−13% и содержанию клейковины в зерне на 0,8%.

Ключевые слова: азотобактер, азотфиксация, фосфатмобилизация, ростстимуляция, антагонизм, урожайность пшеницы озимой.

Vaga L.I. Azotobacter in soils of Forest-steppe of Ukraine: distribution and biological activity. — Manuscript.

Dissertation to receive of a scientific degree of Candidate of Agricultural sciences on a speciality 03.00.07 — microbiology. — Uman' National University of Gardening, Uman', 2010. — Manuscript.

Dissertation to receive of a scientific degree of Candidate of Agricultural sciences on a speciality 03.00.07 — microbiology. — Uman' National University of Gardening, Uman', 2010. — Manuscript.

Dissertation work is devoted to studying of distribution and biological activity of bacteria of sort of Azotobacter in soils of Forest-steppe of Ukraine and selection of the most active cultures, which can influence on the productivity of winter wheat. The systematic observation on a quantity and activity of Azotobacter in soils of agroecosystems of Forest-steppe of Ukraine showed that its quantity and biological activity depended on the terms of edaphotop of its existence. It is ascertained that absolute dominant in soils of Forest-steppe of Ukraine is a type of A. chroococcum, in a typical black soil second on frequency of met — A. vinelandii, and in grey forest soil — A. beijerinckii.

From typical black soil is selected a new culture A. vinelandii 12M, which has a complex agronomical valuable properties, and is characterized by the high level of nitrogen fixing productivity, stimulations of plants growth, mobilization of difficultly soluble phosphates of soil, oppressing of phytopathogenic mushrooms development. In a vegetation and field experiments of winter wheat seeds inoculation with culture of A. vinelandii 12M stimulated growth of plants, increased accumulation of dry matter in phytomass, promoted the yield on 7−13% and maintenances of gluten in a corn on 0,8%.

Key words: Azotobacter, nitrogen fixing, phosphate mobilization, grows stimulation, antagonism, productivity of a winter wheat.