Медичне застосування пеніциліну

ЗМІСТ ВСТУП

1.Медичне застосування пеніциліну

1.1 Дія пеніциліну на бактерії

2. Промислове виробництво пеніциліну

2.1 Напівсинтетичний спосіб отримання пеніцилінів

2.2 Мікробіологічний синтез

2.2.1 Умови утворення пеніциліну

2.2.2 Попередники біосинтезу пеніціліну

2.2.3 Фази процесу розвитку гриба і біосинтезу пеніциліну

2.2.4 Шляхи біосинтезу молекули пеніциліну

2.2.5 Виділення пеніциліну

3.Аналітичний та мікробіологічний контроль виробництва ВИСНОВКИ Перелік посилань

ВСТУП Ера пеніцилінових антибіотиків почалася з відкриття в 1929 р. антимікробних властивостей у цвілеподібного грунтового гриба Penicillium notation, чинного початку — індивідуального з'єднання, названого пеніціліном який запобігав зростання мікроорганізмів Staphylococcus, і виділення з нього в 1940 р. Пеніцилін був першим антибіотиком мікробного походження, який почали виробляти промисловим шляхом. Спочатку його одержували методом поверхневого культивування. Технологія була дуже примітивна — продуцент культивували в колбах або пляшках. Потреба в пеніциліні була дуже висока і обсяг його виробництва, хоча й у примітивних умовах, швидко збільшувався. Для культивування продуцента використовували навіть молочні пляшки, оскільки були машини для їх миття та обробки. У кожну пляшку розміщували живильне середовище шаром товщиною 1−4см, що забезпечувало необхідні умови аерації. Пляшки поміщали у спеціальні кошики, стерилізували, а потім охолоджували. Сухі спори або їх водну суспензію вносили в пляшки особливими пульверизаторами або за допомогою піпетки і ферментували 5−10 діб при температурі 24 ° С.

В даний час в усьому світі пеніцилін отримують, так само як і багато інших антибіотиків, методом глибинного культивування. В якості продуцентів пеніциліну широко використовують штами культури Penicillium chrysogenum, види Penicillium утворюють спори (конідії). У розвитку міцелію спостерігається ряд різних фаз. Спочатку і середині розвитку міцелію в клітинах накопичуються жири. Пізніше їх кількість зменшується, з’являються вакуолі з гранулами рібонуклеополіфосфатів, потім починається автоліз. Інтенсівний синтез пеніциліну починається за наявності великої кількості біомаси міцелію, при повному використанні глюкози і молочної кислоти в середовищі і при рН близькому до нейтрального.

З кількох відомих в даний час природних пеніцилінів найбільш широке застосування отримав самий дешевий і низькотоксичний бензилпеніцилін. Застосовують пеніциліни для лікування пневмоній, ангіни, туберкульозу, дизентерії, ранових та гнійних інфекцій та інших захвопюваннях.

Недоліком більшості пеніцилінів є їх мала кислостійкість (швидкий гідроліз лактамного ядра при прийомі всередину), вузький спектр дії (вони не пригнічують грамнегативні бактерії) і швидкий розвиток резистенції у бактерій.

Для подолання цих недоліків отримано величезне число напівсинтетичних пеніцилінів, серед яких знайдені препарати, досить стійкі до дії кислот і лактамаз. Вони отримали широке застосування в нинішній час. На першій стадії промислового виробництва пеніцилінів здійснюють біосинтез амінопеніциланової кислоти, використовуючи культуральну рідину цвілеподібного гриба або чистий фермент пеніцілінамідогідролазу. На другій стадії хімічної проводять ацилювання аміну відповідної кислотою або її хлорангідридів, отримуючи різноманітні пеніциліни.

1. МЕДИЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ ПЕНІЦИЛІНУ Багаточисельні спостереження показують, що пеніцилін — найбільш коштовне і потужне з відомих засобів для лікування захворювань, що викликаються коками і деякими анаеробними палочкамі. Перевага пеніциліну полягає в тому, що цей препарат — один з найменш токсичних антибіотиків, використовуваних в медичній практиці. Досить вказати, що з 4200 хворих, що отримували пеніцилін, лише в 7 хворих відмічені клінічно виражені токсичні реакції: температурна реакція в 4 больних, некротоксичні реакції з боку центральної нервової системи в 2 хворих і місцева реакція з боку слизистою оболочки порожнині рота в 1 хворого.

В той же час останніми роками спостерігаються випадки анафілактичного шоку після внутршньом’язового введення пеніциліну, що інколи закінчуються смертю хворого.

В цілях уникнення подібних явищ хворим перед введенням пеніциліну необхідно робити нашкірні проби для з’ясування можливої чутливості до антибіотика.

Високі лікувальні властивості і надзвичайно низька токсичність сприяли широкому вживанню пеніциліну в медицині. Одним з перших захворювань, при якому стали застосовувати цей антибіотик, був сепсис (загальна гнійна інфекція). Сепсис найчастіше викликається стафілококами, стрептококами, а інколи і пневмококами. До відкриття пеніциліну в 90% випадків септичні захворювання завершувались летально. В даний час процент смертності від сепсису різко скорочений.

Пеніцилін широко застосовується в хірургії, він з успіхом використовується при лікуванні остеоміелітів (особливо при гострих остеоміелітах), карбункулів, інфікованих ран і інших захворювань. Використання пеніциліну створило широкі можливості при лікуванні таких захворювань, як перитоніт і пневмонія.

У педіатричній практиці пеніцилін має велике значення при лікуванні гнійних ускладнень після скарлатини (гострий лімфаденіт, отити та ін.).

Пеніцилінотерапія займає важливе місце в лікуванні сифіліса (в особливості його ранніх форм).

Частіше бензілпеніцилін застосовують внутрішньом'язовий (засобом ін'єкцій). Бензілпеніцилін при вживанні у вигляді таблеток руйнується під дією шлункового соку.

Застосування кислототривкого типа пеніциліну — феноксиметілпеніциліна дозволяє використовувати антибіотик у вигляді таблеток, що має велике значення при лікуванні дітей.

Залежно від характеру захворювання добова доза антібіотіка складає від 200 000 до 1 0 одиниць.

Останнім часом найбільш широке вживання в медицинської практиці знаходять напівсинтетичні пеніциліни, получені на основі 6-амінопеніциланової кислоти.

1.1 Дія пеніциліну на бактерії

Питанню розгляду антибіотичної активності пеніциліна відносно ряду мікроорганізмів приділено досить багато уваги. Встановлено, що пеніцилін надає антимікробну дію відносно деяких грампозитивних бактерій (стафілококи, стрептококи, диплококи і деякі інші) і практично неактивний відносно грамнегативних бактерій і дріжджів.

Високі концентрації пеніциліну (10 міліграм/мл) викликають гибель клітин гаплоїдного штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae і Escherichia colі.

Антимікробний спектр бензілпеніциліна Мікроорганізм Мінімальна концентрація антибіотика, що пригнічує мкг/мл зростання мікроорганізму

Streptococcus pyogenes …0,004—0,03

Streptococcus pneumoniae …0,006—0,06

Staphylococcus aureus…0,006—0,30

Clostridium tetani …0,02—0,30

Corynebactcrium diphtheriae …0,02—0,30

Streptomyces israeli …0,06—0,30

Nocardia astcroides…30—100

Escherichia coli …20

Klebsiella pneumoniae …100

По характеру дії на мікроорганізми пеніцилін — бактеріостатичний, а в певних концентраціях бактеріоцидний антибіотик.

Різні типи пеніцилінів володіють різною мірою біологічної активності. Відмінність особлива помітно в дослідах in vivo (таблиця. 1.1.1).

Як виходить з даних таблиці, найменшою активністю характеризується n-гептілпеніцилін. Мабуть, це пов’язано з тим, що n-гептілпеніцилін значно швидше інактивується в організмі. Чутливі до пеніциліну мікроорганізми відносно легко і швидко набувають стійкості до антибіотика. Так Staph. aureus припиняє розвиток при концентрації пеніциліну 0,05—0,06 од/мл в середовищі, але вже при 20 послідовних пересівах з концентраціями антибіотика, що поступово збільшуються концентраціями антибіотика стійкість стафілокока зростає в 700 разів, тобто для зупинки зростання бактерії потрібна концентрація пеніциліну, рівна 42 од/мл, а після 40 пересівань його стійкість зростає більш ніж в 5500 разів.

Мікроорганізми, що придбали стійкість до певного типа пеніциліну, як правило, резистентні і до інших типів пеніциліну.

У бактерії стійкість до пеніцилінів супроводжується здатністю утворювати фермент пеніциліназу.

У ряді випадків мікроорганізми з придбанням стійкості до пеніциліну втрачають вірулентність. Але вірулентність відновлюється після декількох пасажів через тварин і при цьому резистентність до антибіотика зберігається.

Таблиця 1.1.1 — Порівняння біологічної активності різних типів пеніцилінів відносно деяких мікроорганізмів в дослідах in vivo

2. ПРОМИСЛОВЕ ВИРОБНИЦТВО ПЕНІЦИЛІНУ До пеніцилінів відносяться біосинтетичні та напівсинтетичні пеніциліни. Біосинтетичні пеніциліни отримують з рідини поживного середовища, на якому вирощують певні види плісневих грибів. Є декілька видів пеніциліна які мають схожу будову і відрізняються тільки радикалом в бічному ланцюгу. Всі вони — похідні 6-амінопеніциланової кислоти, яка є структурною одиницею природнього пеніциліну. На основі 6-амінопеніциланової кислоти був синтезований ряд пеніцилінів які володіють новими цінними для медичної практики властивостями ці пеніциліни називаються напівсинтетичними.

При ферментативному гідролізі пеніциліну з утворенням 6 амінопеніциланової кислоти (6-АПК), яка являється цінним вихідним продуктом при виробництві деяких напівсинтетичних, важливих для медицини аналогів пеніциліну. В промисловості 6-АПК, ядро молекули пеніциліну або бензилпеніциліну при участі штамів, які з високим виходом утворюють в ході ферментації пеніциліназу. Для цієї ж цілі також використовують іммобілізовану пеніциліназу. На основі 6-АПК дістали біля 40 000 напівсинтетичних пеніциллінів. Можливий також процес перетворення бензилпеніциліну в ампіцилін. При цьому спочатку проводять гідроліз бензилпеніциліну здійснюють за допомогою мутантного штамму Kluyvera citrophila, після чого в ферментер вносять мутант Pseudomonas melanogenum і метиловий ефір DL-фенілгліцину. В ролі каталізатора виступає ацилаза, яка утворюється мутантом P. Melanogenum.

2.1 Напівсинтетичний спосіб отримання пеніцилінів Велике значення в даний час має так званий напівсинтетичний (біологічний + хімічний) спосіб одержання аналогів природного пеніциліну, які мають ряд цінних властивостей.

Вихідним продуктом в зазначеному синтезі служить 6-амінопеніциланова кислота (6-АПК):

S

NH₂—СН—СН С (СН₃)₂

| | |

О = С — N — СНСООН

6-амінопеніциланова кислота Кислоту отримують в результаті біосинтезу при розвитку P. chrysogenum в специфічних умовах його культивування (при відсутності попередника в середовищі) або частіше шляхом ферментативного дезацілірування бензилпеніциліну або феноксиметилпеніциліна за участю пеніцилінацилазою (пеніцилінамідази). Вперше на можливість отримання 6-АПК у результаті зміни умов культивування гриба вказав Като (1953). Це з'єднання пізніше було запропоновано отримувати з культуральноі рідини P. chrysogenum, вирощеного в середовищі без попередника. Однак найбільш перспективним засобом отримання 6-АПК є ферментативний метод гідролізу молекули бензилпеніциліном за участю іммобілізованної пеніцілінацілази.

Фермент пеніцилінацилази здійснює гідроліз бензилпеніциліном з утворенням 6-амінопеніциланової кислоти і фенілоцтової кислоти, з'єднаних в молекулі антибіотика карбоксіламідним зв’язком.

Утворення пеніцилінацилази широко поширене серед різних груп мікроорганізмів. Всі продукують пеніцилін гриби здатні утворювати цей фермент. Пеніцилінацілаза, виділена з цвілевих грибів, дріжджів і актиноміцетів, володіє більш високою активністю по відношенню до феноксіметил-, n-гептил і n-амінопеніцилін; фермент отриманий з бактерій і нокардіа, здійснює гідроліз бензілпеніциліна швидше, ніж інших пеніцилінів. Останнім часом запропонован спосіб отримання клітин Escherichia coli, що мають високу пеніцилацілазноу активність і придатних для багаторазового застосування при ферментативному отриманні 6-амінопеніциланової кислоти. Поряд з пеніцилінацилазою є фермент пеніциліназа (пеніцилін-?-лактамаза), який викликає у бензілпеніциліна гидролітичне розщеплення ?-лактамного кільця з утворенням біологічно неактивній бензилпеніцилінової кислоти.

Пеніциліназа і пеніцилінацилаза можуть одночасно продукуватись різними видами мікроорганізмів (Е. coli, Nоcardia, Str. Lavendulae та ін.). Серед вивчених штамів Е. coli 79% виявилися здатними утворювати пеніциліназу, 72% - ацілазу, 59%-продукували обидва фермента одночасно, 6% штамів не утворювали зазначені ферменти. Необхідно зазначити, що 6-амінопеніциланова кислота практично позбавлена антибіотичних властивостей; її біологічна активність складає приблизно одну двохтисячну активності бензілпеніциліна.У даний період найбільш широке застосування в медичній практиці знаходять напівсинтетичні пеніціліни, отримані на основі 6-амінопеніциланової кіслоти.

Отримання 6-амінопеніциланової кислоти в широких масштабах здійснюється за допомогою іммобілізованної пеніцилінамідази. Ферментативний метод гідролізу бензилпеніциліну в порівнянні з кислотним гідролізом має ряд переваг у виході і чистоті основного продукта.

6-амінопеніциланову кислоту піддають хімічному ацилюванню і отримують відповідні аналоги пеніциліну, які мають інші властивості в порівнянні з природними пеніцилінами. У результаті вдалося отримати близько 30 тис. напівсинтетичних пеніцилінів, з них близько 35 антибіотиків застосовуюються в клініці.

В даний час пеніцилін (бензилпеніцилін) дуже необхідний не тільки як хіміотерапевтичний препарат, але і як вихідний матеріал для отримання 6-амінопеніциланової кислоти.

Всі відомі пеніцнліни, подібно бензилпеніциліну, пригнічують синтез клітинної стінки бактерій. Найбільш цінними з практичної точки зору напівсинтетичними препаратами пеніциліну слід вважати ампіцилін, оксацилін, клоксацилін, нафцилін і метіцилін.

2.2 Мікробіологічний синтез

Існує декілька способів отримання нових антибіотиків. Вони базуються на модифікації антибіотиків ферментами мікроорганізмів. Особливо успішно модифікація антибіотиків мікроорганізмами проходить в наступних процесах.

При ферментативному гідролізі пеніциліну з утворенням 6-амінопеніцмлланової кислоти (6-АПК), яка являється цінним вихідним продуктом при виробництві деяких напівсинтетичних, важливих для медицини аналогів пеніциліну. В промисловості 6-АПК, ядро молекули пеніциліну або бензилпеніциліну при участі штамів, які з високим виходом утворюють вході ферментації пеніцилін азу. Для цієї ж цілі також використовують іммобілізовану пеніциліназу. На основі 6-АПК дістали біля 40 000 напівсинтетичних пеніцилінів. Можливий також процес перетворення бензилпеніциліну в ампіцилін. При цьому спочатку проводять гідроліз бензилпеніциліну здійснюють за допомогою мутантного штаму Kluyvera citrophila, після чого в ферментер вносять мутант Pseudomonas melanogenum і метиловий ефір DL-фенілгліцину. В ролі каталізатора виступає ацилаза, яка утворюється мутантом P. Melanogenum.

2.2.1 Умови утворення пеніциліну Пеніцилін відноситься до групи ?-лактамних антибіотиків. В останні роки встановлено, що антибіотики цієї групи утворюються не тільки пліснявими грибами, а й деякими видами актиноміцетів і власне бактерій.

Отримання пеніциліну — велике досягнення у розвитку мікробіологіі, хімії та медицини. Важливим етапом у збільшенні виходу пеніциліну було вивчення умов утворення антібіотіка.

Перше середовище для глибинного утворення пеніциліну було розроблена Мойером і Кохіллом в 1946 р., до його складу входив кукурудзяний екстракт, лактоза, NaNО3, глюкоза, однозаміщений фосфорнокислий калій та інші солі. Це середовище було основною, на його базі були розроблені середовища, які використовуються при промисловому виробництві пеніциліну. Наприклад, в якості посівного середовища часто застосовують середовище наступного складу:

Кукурудзяний екстракт (твердий) … 20 г Глюкоза 40 г КН2Р04 0,5 г

NaNО3 3 г

MgS04−7H2O 0,125 г Крейда 5 г Вода водопостачальна до 1000 мл рН після стерилізації 6,0—6,1

Для промислового виробництва антибіотика використовують середовище наступного складу (%):

Кукурудзяний екстракт (по сухому залишку) … 0,3

Гідрол … 0,5

Лактоза …0,3

NH4NО3 … 0,125

Na2 SO3−5H 2O … 0,1

Na2SО4−10НаО … 0,05

MgSО4−7H2О … 0,025

MnSО4−5H2О … 0,002

ZnSО4 … 0,002

KH2PО4 … 0,2

CaCО3 … …0,3

Фенілоцтова кислота … 0,1

Досить часто в середовищах використовують суміш лактози з глюкозою у відношенні 1:1. У ряді випадків замість кукурудзяного екстракту застосовують арахісове борошно, жмихи, борошно з бавовняних насіннь та інші рослинні матеріали.

Можливість широко застосовувати в якості компонентів середовищ різні продукти рослинного походження зумовлена тим, що продуцент пеніциліну P. chrysogenum утворює сильні протеолітичні ферменти. За інтенсивністю дії можуть бути виділені три ферменти, що розрізняються значенням рН середовища, забеспечуючи їх оптимальну дію: 1) протеіназа з оптимальною дією при рН 5,0−6,5; 2) протеіназа типу триптазу з оптімумом дії при рН 7,0−7,5; 3) пептідази з оптимальною дією при рН 8,0−8,4. Протеолітичні ферменти гриба здатні виробляти дезагрегацію та протеоліз білка. Зазвичай максимально протеолітична активність гриба збігається з максимум виходу пеніциліну.

Завдяки високим протеолітичних властивостями гриба наявність кукурудзяного екстракту або іншого рослинного матеріалу в середовищі повністю забезпечує продуцент пеніциліну азотом. У результаті вивчення обміну азоту у зв’язку з утворенням речовини було зроблено припущення, що більша частина антибіотиків утворюється на ранніх стадіях росту гриба з азотистих запасів міцелію і що утворення білків може бути конкуруючим фактором, що лімітує утворення пеніціліна.

Порівняльне вивчення азотного обміну у продуцента пеніциліна P. chrysogenum і його неактивного мутанта показало, що дійсно основна частина азоту середовища, починаючи з 2 діб розвитку, використовується продуцентом антибіотика на біосинтез пеніциліна, а у неактивного мутанта азот продовжує використовуватись на інтенсивний ріст біомаси. Хімічний склад міцелію і його окремих азотовмісних фракцій суттєво не відрізняється у цих штамів.

В якості єдиного джерела вуглецю середовища кращим з'єднанням для біосинтезу пеніциліна визнана лактоза, оскільки вона використовується грибом повільніше, ніж, наприклад, глюкоза, в результаті чого в період максимального утворення антібіотика лактоза ще міститься в середовищі. Це створює найбільш сприятливі умови для утворення пеніциліну. На середовищі з глюкозою відбувається прискорення всіх обмінних процесів. Максимум утворення пеніциліну спостерігається приблизно через 50 год, тобто через 2діб після початку розвитку гриба, а глюкоза використовується організмом за перші 30−40 год зростання. У присутності ж лактози максимальне утворення пеніцилна відбувається через 6−7 діб, а лактоза споживається грибом приблизно за 6 діб.Однак у середовищі для розвитку P. chrysogenum лактозу можна замінювати легко використовуваними вуглеводами — глюкозою, сахарозою, галактозою, ксилозою, крохмалем (гідролізованим) за умови їх безперервного введення в середовище. Якщо глюкозу, наприклад, подавати в середовище безперервно з швидкістю 0,032% за 1 год, вихід пеніциліну на кукурудзяному середовищі в порівнянні з лактозною підвищується на 15%, а на синтетичній — на 65%.

У процесі розвитку гриба при заводському отриманні пеніциліна для боротьби зі спінюванням середовища використовують, як правило, рослинні олії. Однак було відмічено, що ці речовини не є інертними компонентами субстрату; певні концентрації, наприклад, соняшникової олії впливають на біосинтез пеніциліну. Додавання соняшникової олії до середовища у концентрації, що не перевищує 1%, не впливає на утворення антибіотика. Підвищення концентрації олії приводить до різкого зниження виходу бензилпеніциліну.

Токсичний ефект масла на процес утворення пеніциліна, мабуть, носить непрямий характер, пов’язаний з порушенням дифузії кисню в клітини міцелію, обумовленим утворенням масляної плівки між стінкою клітини і газоподібної фазою культуральної рідини.

Соняшникова олія в концентрації від 0,1 до 10% не надає токсичного впливу на ріст міцелію гріба.

При розвитку продуцента антибіотика в струшуємих колбах без додавання масел вихід пеніциліну різко знижується. Додавання органічних кислот (малеїнової в кількості 1 г / л один раз на добу чи янтарної 1 г / л два рази на добу) в дослідах на гойдалках дає можливість отримати вихід антибіотика до 3000 од / мл. Ненасичені жирні кислоти, этанол, молочна та лимонна кислоти також сприяют підвищенню утворення пеніциліна. У ферментерах з перемішуванням після додавання цукру, малеїнової та янтарної кислот і при регулюванні вспіненнюя задопомогою невеликих кількостей суміші рослинних і вуглеводневих масел виходи антибіотика досягали 5000 од / мл. Деякі масла не використовуються грибом, частина масел окислюється до СО2, а деяка кількість їх включається в різні фракції цвілі. Тільки сліди масла, міченого 14С, включаються в пеніцілін.

Важливе значення у процесі біосинтезу пеніциліну має сірка. Продуценти антибіотика добре використовують в якості джерел сірки сульфати (наприклад, Na2SО2) і тріосульфати (наприклад, Na2S2О3) .

Іони міді, взяті у концентрації більшій, ніж 2 мг на 1л, повністю пригнічують утворення пеніциліну, але не впливають на зростання гриба. Якщо ж до середовища, що містить мідь у концентрації, яка гальмує біосинтез антибіотика, додати залізо (1 мг / л), ефект гальмування знімається.

Важкі метали в нейтральних і лужних середовищах можуть вступати в реакцію з фосфатами, утворюючи нерозчинні солі; разом з тим вони можуть утворювати хелати з амінокислотами, діі трикарбонових кислот, наявними в средовищі.

В якості джерел фосфору P. chrysogenum можна використовувати як фосфати (КН2РО4), так і фітати (солі інозітфосфорних кислот). Продуцент пеніциліну містить фермент, руйнiвний фітин зі звільненням неорганічного фосфора.

Оптимальною температурою для розвитку гриба і біосинтезу пеніциліну в першій фазі є температура 30 ° С, у другій фазі - 20 ° С.

Велике значення для утворення пеніциліну має аерація культури; максимальне накопичення пеніциліну відбувається при інтенсивності аерації, близькою до 1.

Зменшення інтенсивності аерації або її черезмірне збільшення приводять до зниження біосінтеза антибіотика. Значну роль при цьому має перемішування культури. Так, зі збільшенням потужності, яка витрачається на обертання мішалки в ферментері на 7500л, швидкість споживання лактози збільшується і біосинтез антибіотика зростає. Від способу перемішування культуралиюй рідини залежать форма і величина глибинних колоній, стан яких визначає ступінь здатності міцелію утворювати пеніцилін. У процесі розвитку P. chrysogenum штам 194 в середовищі накопичуються продукти обміну гриба, токсичні для біосінтеза пеніциліну. Причиною утворення цих продуктів, імовірно, є автоліз міцелію. Добавки поживних речовин по ходу розвитку продуцента антибіотика знижують процес автолізу міцелію гриба і сприяють мінімальному утворенню токсичних речовин.

Високий вихід пеніциліну, таким чином, може бути отриманий при наступних умовах розвитку гриба: гарне зростання міцелія, достатнє забезпечення культури поживними речовинами і киснем, оптимальна температура (в період першої фази 30 ° С, у період другої фази 20 ° С), рівень рН нижче 8,0 (але не нижче 7,0), повільне споживання вуглеводів, наявність відповідного попередника. Для періоду фази росту гриба бажано мати рН середовища нижче 7,0 і обов’язкова присутність у середовищі легко доступного джерела вуглецю. Повільне споживання вуглеводів під час фази утворення пеніциліну досягається або використанням лактози, або дробовим внесенням глюкози або іншого цукру.

пеніцилін бактерія біосинтез гриб

2.2.2 Попередники біосинтезу пеніціліна

Penicillium chrysogenum в процесі життєдіяльності утворюються різні типи пеніцилінів (пеніциліни G, X, F і К), відрізняється будовою радикала молекули, величиною антибиотичної активності та спектр біологічної дії. Велику роль у процесі біосинтезу пеніциліну визначенного типу і в збільшенні його виходу грають так звані попередники. Попередниками можуть служити тільки ті органічні речовини субстрату, які в процесі біосинтезу антибіотиків тим чи іншим шляхом включаються до його молекули. Організм-продуцент пеніциліну включає в молекулу антибіотика деякі органічні сполуки або частину їх без попереднього розщеплення на окремі фрагменти і подальшого ресінтеза.

У роботах Левітова з співробітниками показано, що в окремих випадках при введенні одного попередника в середовище відбувається утворення декільких пеніцилінів. Ці спостереження вказують, що речовини, які застосовуються як попередники, в процесі розвитку гриба також можуть під дією ферментів, утворюваних нею, змінюватися, а потім включатися в біосинтез молекули пеніциліну поряд з іншими компонентами середовища.

Попередники під впливом гриба здатні окислюватися до СО2 і води. Різні типи пеніцилінів, утворені грибом, близькі за хімічною будовою. Відмінність в їх структурі визначається лише будівлею радикала. Радикал з'єднується із загальним для всіх типів ядром молекули пеніциліну.

?- лактамне кільце тіазолідінове кільце

S

R—CO—HN—СН—СН С (СН₃)₂

Бічний ланцюг | | |

О =С—-N—— СНСООН

6-амінопеніциланова кислота.

Мойєр і Когхіл (1947) одними з перших встановили, що при додаванні до культури гриба фенілоцтової кислоти вихід пеніциліну підвищується на 30−50%. Пізніше було показано, що фенілоцтова кислота і багато її похідні попередники біосинтезу пеніциліну. Присутність в кукурудзяному екстракті фенілетіламіна (C 6H 5CH 2CH2NH2) сприяє утворенню бензилпеніциліну, у даному випадку фенілетиламін виступає також як попередник бензилпеніциліну (пеніцилін G).

Залежність утворення того чи іншого типу пеніциліну від наявності в середовищі попередника представлена в таблиці 2.2.2.1

Таблиця 2.2.2.1 — Вплив додавання попередників до кукурудзяного середовища на утворення пеніциліну культурою Penicillium chrysogenum

Наведені в табл. 2.2.2.1. дані дозволяють зробити наступні висновки: 1) при розвитку гриба в середовищі без додаткового внесення попередника утворюється близько 45% бензилпеніциліну і близько 53% пеніциліну К, з віком культури біосинтез зсовується в бік утворення пеніциліну К (до 70%); від загального вмісту в культуральній рідині суміші пеніцилінів і зменшення К-пеніциліну. У процесі культивуваня P. chrysogenum в середовищі, що не містить фенілоцтової кислоти, в культуральній рідині накопичуються сірковмісні з'єднання не ?-лактамні характеру. 2) при додаванням до середовища похідних фенілоцтової кислоти спостерігається збільшення виходу пеніциліну і змінюється співвідношення утворившихся компонентів у бік збільшення G-пеніциліну, кількість якого залежно від віку міцелію досягає 75 — 99% від загального вмісту в культуральної рідині суміші пеніцилінів і зменшення К-пеніциліну. У процесі культивування P. chrysogenum в середовищі, що не містить фенілоцтової кислоти, в культуральній рідині накопичуються сірковмісні з'єднання не ?-лактамного характеру. За хроматографічної активності вони близькі до цистеїну (CH2SH-CHNH2-СООН) і метіоніну (CH2SCH3-CH2-CHNH2-СООН). Додавання до середовища для культивування гриба фенілоцтової кислоти призводить до більш інтенсивного перетворення сірковмісних компонентів у зв’язку ?-лактамного характера.

Різні штами P. chrysogenum по-різному відноситься до попередника: чим активніше штам, тим «економічніше» він використовує такий попередник, як фенілацетамід.

У залежності від штаму відбувається використання різних кількостей попередників (від 0,1 до 10%) для синтезу антибиотику. При цьому від 5 до 30% попередників залишається в середовищі, а більша частина його окислюється організмом до СО2 і води, тобто використовується за іншими шляхами обміну речовин. Однак окремі штами в певних умовах перетворюють на антибіотик практично весь обсяг попередника (фенілацетамід), якщо його початкова концентрація не перевищує 1 мг / мл. Штам Wis-51−20 перетворює на пеніцилін тільки близько 40% попередника. При додаванні до синтетичного середовища 0,1% феноксиоцтовой кислоти P. chrysogenum утворює феноксіметілпеніцилін (пеніцилін V). На середовищі з кукурудзяним екстрактом в присутності того ж попередника поряд з пеніциліном V утворюються також пеніциліни інших типів (до 25% від загального виходу антибиотиків).

Серед різних пеніцилінів феноксіметілпеніцілін має значно більш високу стійкість в кислому середовищі, що істотно відрізняє його від бензилпеніциліну та інших пеніцилінів.

Відзначено, що попередники біосинтезу пеніциліну (фенілоцтова кислота, фенілацетамід, феноксіоцтова кислота) за певних концентраціях і рН середовища надають токсичну дію на P. chrysogenum. З названих попередників фенілоцтова кислота має найменшу токсичність. Додавання фенілоцтової кислоти в середу при концентрації вище 500 мкг / мл пригнічує ріст міцелію гриба особливо в перші 24 годин його розвитку. Додавання ж цієї кислоти до субстрату в кількості від 100 до 500 мкг / мл, навпаки, стимулює ріст міцелію цвілеподібного гриба. Оптимальною концентрацією фенілоцтової кислоти, доданої через 24 годин після початку розвитку P. chrysogenum, що забезпечує найбільший вихід пеніциліну (за даними через 72 год розвитку гриба), буде 500−1000 мкг / мл. Одночасне внесення в середу фенілоцетової кислоти в концентрації 1000 мкг/мл і 1% соняшникової олії приводить до повного припинення процесу біосинтезу пеніциліну при нормальному зростанні гриба.

На думку Левітова (1957), процес біосинтезу певного пеніциліну при додаванні до середовища «попередника» з біологічної точки зору — процес знешкодження токсичної для організму речовини шляхом скріплення його продуктами обміну гриба в результаті «захисного синтезу». Цим і пояснюється ефект утворення пеніциліну при повторному введенні в середовище, наприклад, фенілоцтової кислоти; повторне введення попередника викликає у відповідь реакцію організму, що характеризується посиленим процесом скріплення попередника. Ідею утворення антибіотиків, пов’язану із захисним синтезом, в результаті якого відбувається детоксикація шкідливого (шкідливих) для мікроорганізму продукту метаболізму, пізніше була розвинена Дармом і Каном. Утворення таких «двокомпонентних» антибіотиків, як актіноміцини, макроліди та ін., відбувається, на думку цих авторів, в результаті знешкодження деяких токсичних для організмів речовин шляхом скріплення їх з іншими речовинами, що дозволяє утворитися продукту, нейтральному для продуцента. Наприклад, до складу макролідних антибіотиків входить вуглеводний компонент піраноза. Дар і Кан передбачають, що утворення вказаних антибіотиків обумовлено реакцією знешкодження цього цукру, з утворенням дезозамінів. Біосинтез ж актіноміцинів, на їх думку, пов’язаний із знешкодженням гетероциклічних фрагментів дорогою їх пептідізації.

Таблиця 2.2.2.2 — Вміст пеніциліну у фільтраті, екстракті з кліток і в стінках кліток в процесі розвитку гриба.

Основна маса пеніциліну в процесі біосинтезу виділяється в довкілля і лише невелика кількість антибіотика міститься усередині міцелія гриба і в клітинній стінці (таблиця. 2.2.2.2).

Приведені в таблиці. 2.2.2.2 дані показують, що відносний вміст пеніциліну в екстракті і стінках клітин по відношенню до загальної кількості антибіотика залишається постійним і не перевищує 0,8%.

2.2.3Фази процесу розвитку гриба і біосинтезу пеніциліну Зміни, що відбуваються в міцелії гриба P. chrysogenum і в культурній рідині в процесі біосинтезу пеніциліну, мають певний фазовий характер.

При розвитку гриба на кукурудзяно-лактозному середовищі можна виділити три фази.

Перша фаза — зростання міцелія; вихід антибіотика досить низький. Молочна кислота, завжди присутня в кукурудзяному екстракті, споживається організмом з максимальною швидкістю. Лактоза в цей період розвитку гриба використовується повільно. В середу виділяється аміак, що різко піднімає значення рН середовища.

Друга фаза — максимальне утворення пеніциліна, зв’язане з швидким вжитком лактози і амонійного азоту. Збільшення маси міцелія незначне; рН середовище залишається майже без зміні.

Третя фаза — зниження концентрації антибіотика в середовищі. У зв’язку з автолізом міцелія, що почався, відбувається виделення аміаку, що супроводжається деяким підвищенням рН середовища.

Виходячи з положення Шапошнікова про двофазності ряду мік-робіологічних процесів, характер розвитку P. chrysogenum, біохімічні зміни в субстраті і біосинтез пеніциліну за умови, що гриб починає розвиватися при засіві середовища спорами або міцелієм, що не перейшов ще в стадію антнбіотикоутворення, можуть бути також розділені на дві фази.

У першій фазі розвитку спостерігається посилене зростання гриба, відбувається енергійний вжиток джерел вуглецю, посилюється азотний обмін, рН середовища значно зростає, вжиток кисню високий. Утворення антибіотика в першій фазі, практично не відбувається. У другій фазі значно знижується приріст міцелія гриба, знижується інтенсивність поглинання кисню, рН середовища майже не змінюється. Основна маса джерела вуглецю вже використана. У цей період відбувається утворення основної кількості пеніциліну (мал.2.2.3.1).

U 20 40 6О 80 100 120

Мал. 2.2.3.1. Біохімічні зміни у зв’язку з утворенням пеніциліну при розвитку гриба у ферментері (по Herold, 1957)

1 — вміст пеніциліну в середовищі од/мл ?1000 (шкала А), 2—масса сухого міцелія, г/100 мл (шкала А), 3 — лантоза, міліграм/мл (шкала В), 4 — рН—10 (шкала D), 5 — So2 (сульфат) міліграма/мл (шкала З), 6 — аміачний азот, міліграм/мл (шкала D), 7 — аміний азот, міліграм/мл (шкала D).

Беккер, Смирнова та ін. (1956—1957) описали наявність шести умовно виражених вікових фаз, визначенних при цитологічному і цитохімічному вивченні продуцентів пеніциліна.

Встановлено, що в помітній кількості пеніцилін починає утворюватися лише з IV вікової фази гриба. Максимум накопичення антибіотика в культуральному середовищі доводиться на VI фазу в період автоліза.

Визначення вікових фаз і пов’язаного з ними біосинтезу пеніциліна дорогою мікроскопічного контролю за культурою дозволяє встановити: 1) хід загального темпу розвитку гриба з з’ясуванням його вікового стану, придатного для використання посівного матеріалу, і контролю за ходом утворення антибіотика;

Таблиця 2.2.3.1. — Зміни хімічного складу міцелія Penicillium chrysogenum в динаміці його розвитку (по Баськакової і Якимову, 1965)

1)наявність дефектів розвитку і можливих причин цих дефектів;

2)момент закінчення розвитку гриба у ферментерах. Даний по зміні вміст загального азоту, білка, вуглеводів і жиру представлені в таблиці. 2.2.3.1.

Кількість загального азоту і вміст білка в міцелії по ходу розвитку гриба зменшуються. Вміст моноцукрів в міцелії до періоду максимального біосинтезу пеніциліну (96 ч) збільшується приблизно в 6 разів в порівнянні з початковим періодом розвитку P. clirysogenum, кількість діцукрів зменшується.

Амінокислотний склад білків міцелія пеніцила в якісному відношенні не залежить ні від середовища, на якому розвивається гриб, ні від віку міцелія. Проте кількість окремих амінокислот значно змінюється як по ходу розвитку пеніцила, так і залежно від складу середовища. Всього в міцелії гриба визначено 12 амінокислот (цистеїн + цистин, лізин, гістидин, аргінін, глікокол, глутамінова кислота, аспарагінова кислота, аланін, тирозін, валін, фенілаланін, лейцин).

Зміна складу вказаних амінокислот в гідролізаті білка міцелія P. clirysogenum по ходу розвитку гриба наведено в табл.2.2.3.2

Таблиця 2.2.3.2 -Зміна вмісту амінокислот білка міцелія (% від сухої речовини) в динаміці зростання гриба (по Баськакової і Якимову, 1965)

Лізин, що міститься в міцелію гриба в значній кількості по ходу розвитку пеніциліну, надає пригноблюючу дію на біосинтез пеніциліну клітинами гриба, що покояться. В той же час ще раніше було показано, що приблизно чверть штамів P. notatum, що не містять лізину, виявилася нездібною до біосинтезу пеніциліну.

H2N—(СН 2)4—CHNH2—СООН НООС—(СНа)3—CHNH2—COOH

Лізин a-Аміноадіпінова кислота Дія лізину, пригноблююча біосинтез пеніциліну, може бути знято додаванням до субстрата а-аміноадіпінової кислоти.

Процес біосинтезу пеніциліну необхідно проводити при самому ретельному дотриманні стерильності всіх операції — забруднення культур сторонньою мікрофлорою викликає різке сніження накопичення антибіотика. Відомо, що багато бактерій, зазвичай ті, що зустрічаються в повітрі здатні утворювати фермент пеніцилінази, що розщеплює пеніцилін. Пеніциліназа інактивує пеніцилін унаслідок розриву (5-лактамного кільця молекули антибіотика). Особливо активно продукують пеніцилліназу Вас. subtilis і Вас. cereus. Забруднення культури гриба однією з цих бактерій може привести до різкого зниження кількості антибіотика в культуральній рідині.

Температурний оптимум дії пеніцилінази 37 °C. Одним з активних продуцентів пеніцнлінази виявилася туберкульозна паличка Mycob, tuberculosis. Можливо, саме з цією властивістю пов’язана нечутливість туберкульозних паличок до пеніциліну.

2.2.4 Шляхи біосинтезу молекули пеніциліну Як вже наголошувалося, направлений біосинтез того або іншого типа пеніциліну забезпечується додаванням до середовища для культивування P. chrysogenum фенілоцтової кислоти або її похідних, а також інших з'єднань — попередників молекули пеніциліну. Отже, ці з'єднання, які включають в бічний ланцюг молекули пеніциліну, визначають направленність біосинтезу антибіотика. В даний час отримані данні, сприяючі розкриттю доріг біосинтезу основної біоциклічної структури пеніциліну — 6-амінопеніциланової кислоти і всієї молекули антибіотика.

Використання сучасних високоефективних методів дослідження шляхів біосинтезу молекули пеніциліну, у тому числі вживання протопластів грибів (клітин, позбавлених стінок) і їх лізатів, мутантів грибів-продуцентів цих антибіотиків, заблокованних по різним етапам біосинтезу молекули пеніциліна, а також широке використання мічених сполук, в тому числі амінокислот, що входять в молекулу антибіотика, дозволяє з великою достовірністю визначити основні дороги біосинтезу молекули пеніциліна.

Встановлено, що молекула пеніциліну утворюється з l-цистеїну, l-валіну і неполярних карбонових кислот —попередників бічного радикала молекули пеніциліну. Окрім вказаних з'єднань обов’язковим компонентом процесу біосинтезу пеніциліну є L-а-аміноадіпінова кислота (L-а-aak). Утворення аміноадіпінової кислоти походить з кетоглутарату і ацетіл-КоА за наступною схемою:

О= С — СООН Н ₂N— СН—СООН

| |

О=С—СООН СН₂ СН₂

| | |

СН₂ + СН₅ СООН > СН₂ > СН₂

| | |

СН₂ — СООН СН₂—СООН СН₂—СООН

Кетоглуатарова Кетоадипінова Аміноадипінова

кислота кислота кислота

Першим етапом біосинтезу молекули пеніциліну слід вважати утворення трипептиду: L-аміноадипілL-цистєїнілD-валін (LLD). Відмічено, що на початку процесу утворюється діпептид (L-а-аміноадипілLцистеїн), який потім, взаємодіючи з Lваліном, утворює трипептид. L Ld-трипепид перетворюється на ізопеніцилін N через моноциклічний ?-лактам.

Утворення ?-лактама відбувається в результаті замикання кільця між С-3-цистєїна і NH-групою валіну. Цей процес — перша стадія циклізації - LLD тріпептіду в первинний антибіотик — ізопеніциллін N.

Первинне утворення основного ядра молекули пеніциліна— 6-амінопеніциланової кислоти (6-АПК) було показано при культивуванні гриба в середовищі, попередника, що не містить, а потім 6-АПК була виділена з культуральної рідини продуцента пеніциліну і визначена її будова.

Пізніше багато дослідників шукали в P. chrysogenum фермент, що перетворює молекулу 6-АПК в пеніцилін, тобто здійснює її ацилування. В результаті в 1968 р. з’явилося повідомлення про наявність в міцелії гриба ферменту пеніцилінацилтрансферази, здатного здійснювати перенесення ацильной групи різних пеніциллінов на 6-АПК. Причому було показано, що утворення ферменту збігається з періодом активного процесу біосинтеза пеніциліну; отже, фермент приймає безпосередню участь в процесі біосинтезу молекули пеніциліну.

Таким чином, можна стверджувати, що в процесі утворення пеніциліну ізопеннциллін N і 6-АПК і є безпосередні попередники.

Механізм біосинтезу молекули пеніциліну представлений на схемі.

Кетоглутарат + Ацетил-КоА

v

Гомоцитрат

v

а-кетоадипінова кислота

v

L-a- аміноадипінова кислота (L-a-AAK) L-цистеїн

v

L-a-AAK-L-цистеїн (LL-дипептид)

v< L-валін

L-а-ААК-L-цистеїн-D-валін (LLD-трипептид)

v

Моноциклічний ?-лактам

v

Ізопеніцилін N (L-a-AAK-6-АПК)

С₆Н₅СН₂СООН > v

Бензилпеніцилін (С₆Н₅СН₂СО?6-АПК)

2.2.5 Виділення пеніциліну Перший етап при виділенні пеніциліну, як і багатьох інших антибіотиків, що накопичуються в культуральному середовищі, —відокремлення міцелія гриба від культуральної рідини шляхом фільтрації або центрифугування. Щоб уникнути втрат антибіотика міцелій гриба відокремлюють і промивають.

Витягання пеніциліну з культуральної рідини в теперешній час зазвичай проводять методом екстракції антибіотика органічними розчинниками, що не змішуються з водою (амілацетат, хлороформ бутилацетат, бутиловый спирт и др.).

Процес екстракції антибіотика з культуральної рідини заснований на методі заміни розчинників, що полягає в тому, що пеніцилін у вигляді вільної кислоти може бути екстрагіруваний яким-небудь розчинником, а потім знову переведений у водний расвор у вигляді солі шляхом додавання певної кількості лугу. Солі пеніциліну погано розчинні у вказаних органічних розчинниках, тому їх можна майже кількісно перевести з органічного розчинника у водний розчин. Повторення таких операцій сприяє концентрації і очищенню препарата.

3. АНАЛІТИЧНИЙ ТА МІКРОБІОЛОГІЧНИЙ КОНТРОЛЬ ВИРОБНИЦТВА Поняття контроль виробництва включає весь комплекс хімічних, біохімічних і мікробіологічних аналізів і вимірювань з обліку якісних і кількісних показників технологічного режиму на всіх етапах виробництва, починаючи з визначення якості сировини і закінчуючи оцінкою якості готової продукції. Контроль за виробництвом здійснюється шляхом відбору проб і проведення відповідних аналізів, а також за допомогою контрольновимірювальних приладів.

Простежимо основні етапи виробництва, що підлягають контролю:

— аналіз сировини та допоміжних матеріалів, з метою визначення відповідності їх вимогам стандартів та супровідної документації;

— перевірка справності, надійності, герметичності і других показників обладнання, апаратури та комунікаційнихних ліній перед початком технологічного процесса.

На кожній дільниці виробництва ведуть оперативний контроль за дотриманням встановлених технологічним регламентом параметрів процесу. Контроль проводиться шляхом виконання експрес-аналізів і постійного спостереження за показаннями контрольно-вимірювальних приладів.

Наведемо кілька прикладів використання контрольно-вимірювальних приладів на стадії культивування мікроорганізмів. Одним з найважливіших факторів, що впливають на біосинтез і ріст клітини, є рН середовища. Цей показник особливо різко змінюється в процесі вирощування мікроорганізмів глибинним способом. У залежності від складу середовища та продуктів метаболізму рН може зрушуватися як в кислу, так і в лужну сторону.

З появою стерилізуючих електродів з’явилася можливість безперервно і автоматично здійснювати в ферментаторі контроль за зміною рН середовища. При змінах рН виникає сигнал передається на прилад самописця-регулятора, після чого спрацьовує клапан, забезпечуючий коригування рН середовища. Практично завжди виявляється, що досить додати кислоту або луг для отримання потрібного рН середовища.

Електроди рН-метра можуть розміщуватися в виносному пристрої або безпосередньо в корпусі ферментатора.

Для успішного вирощування мікроорганізмів велике значення має запобігання утворення піни. Найбільш часто піноутворення спостерігається в процесах ферментації у яких використовуються природні живильні середовища, наприклад містять кукурудзяний екстракт і соєве борошно.

Мал3.1. Контроль рН в промисловому ферментаторі: 1 — ємкість для кислоти або луг: 2 — соленоїдній клапан; 3 — рН вимірювальник та самописець; 4 —з'єднувальна коробка; 5 —скляний электрод; 6 — температурний компенсатор; 7 —допоміжний електрод.

Інтенсивне піноутворення збільшує скорість розчинення кисню повітря в середовищі (утворюється велика поверхня масообміну), викликає зволоження повітроочисних фільтрів, порушує герметизацію і стерильність процесу, ускладнює максимальне використання ємності ферментатори і тим самим знижує вихід кінцевого продукту. Для запобігання викиду піни з ферментатора застосовують механічні, хімічні, фізичні, комбіновані та інші методи піногасіння. В даний час всі ферментатори постачають спеціальними автоматичними пристроями для введення піногасителя і контролю висоти піни в апараті.

У системі автоматичного піногасіння, розробленого Всесоюзним науково-дослідним інститутом антибіотиків (ВНДІА), висота підйому піни в ферментаторі контролюється на трьох заданих рівнях, тобто застосовуються три контактні електроди, які з'єднуються з електронно-механічним програмним пристроєм .

При досягненні піною нижнього електрода відбувається імпульсна подача хімічного піногасника. Коли піна досягла середнього електрода, перекривається вихлопна повітряна лінія, при цьому тиск в апараті підвищується і піноутворення різко зменшується. Якщо піна досягне верхнього електроду, то відключиться електродвигун мішалки. Коли піна спадає система приводиться в первинний стан.

Добре зарекомендувала себе комбінована система піногасіння, розроблена в Інституті мікробіології ім. А. Кірхенштейн АН Латвійської РСР.

Сигнал від електрода приводить в дію підсилювач, котрий замикає контакти реле часу для включення першого регулятора, що приводить у дію виконавчий механізм (механічний піногасник). При спрацьовуванні першого регулятора імпульс надходить також і в реле часу, яка після закінчення заздалегідь встановленого проміжку приводить у стан готовності другий регулятор (підсилювач і імпульсний генератор), призначений для запуску виконавчого механізму хімічного піногасіння Х1 Х2 (солоноїдний клапан або перистальтичний насос). Якщо рівень піни не знижується нижче контрольного електрода, то сигнал викликає повторну дію другий регулятора. При спрацьовуванні цього регулятора сигнал надходить в наступний, третій, регулятор СП і ІГ2 (стежить повторювач, імпульсний генератор), який в разі необхідності запускає інший, більш ефективний у дії механізм Х2 (соленоїдний клапан) хімічного піногасіння.

У значній мірі ефективність мікробіологічного виробництва залежить від постановки мікробіологічного контролю. Контролюються музейна культура мікроорганізма-продуцента, посівний матеріал, живильні середовища, повітря, культуральна рідина, а також готова продукція. В залежності від призначення мікробіологічної продукції (для харчової, медичної промисловості, сільського господарства) пред’являються різні вимоги до її обсіменіння. Наприклад, продукти, використовувані в медичній промисловості, повинні бути практично вільні від мікроорганізмів.