Актинобацилезна (гемофілезна)

МІНІСТЕРСТВО СПІЛЬНОГО І ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО.

ОСВІТИ РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦИИ.

Московський Державний університет прикладної биотехнологии.

На правах рукописи.

УДК 619.4: 616.9.

СКОРОДУМОВ.

Дмитро Иванович.

АКТИНОБАЦИЛЛЁЗНАЯ (ГЕМОФИЛЁЗНАЯ).

ПЛЕВРОПНЕВМОНІЯ І ГЕМОФИЛЁЗНЫЙ ПОЛИСЕРОЗИТ СВИНЕЙ (ЭТИОЛОГИЯ,.

ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА, ОСНОВЫ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФИЛАКТИКИ.

АКТИНОБАЦИЛЁЗНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ).

16.00.03. — ветеринарна микробиология, вірусологія, эпизоотология і микология.

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття вченою ступеня доктора ветеринарних наук.

Москва — 1997.

1. Загальна характеристика работы.

Актуальність проблеми. Хвороби свиней представляють жодну з значимих проблем ветеринарної науку й практики. Переклад свиновод-ства на промислову технологію виявив значення низки інфекційних захворювань, які доти залишалися поза увагою фахівців. До цієї категорії бактериозов свиней можна віднести актинобациллёзную (гемофилёзную) плевропневмонию і гемофилёзный полисерозит свиней (Сидоров М.А., 1987, 1988; J. Nikolet, 1976, 1983, 1986; Schultz R. A., 1985; Schope R. E. et al, 1964; Sebunya T.N.K. et al, 1983; Rsing H. J., 1979,1980, 1991; Rosendal P. S. et al, 1983; Nielsen R., 1982,1995; Kielsten P. і.а., 1980, 1190, 1992, 1994; і другие).

Актинобациллёзная (гемофилёзная) плевропневмонія придбала повсюдне поширення, завдає значні економічні збитки, з великими труднощами піддається лікування та специфічної профілактиці (Beaudet R, et al, 1994; Byrd W. et al 1992; Fedorka — Grey P. P. S. et al., 1990; Beskow P. et al ., 1989; Bigbee H. З. et al, 1986; та інших.).

Гемофилёзный полисерозит (хвороба Глессера) у зв’язку з впровадженням у технологію свинарства використання СПФ — тварин несподівано виявив себе, немов захворювання, здатне вражати все вікові групи свиней, в на відміну від сформованого вистави як хворобу, до котрої я чутливі поросята- -отъёмыши, піддані впливу стресс—факторов (Amano H. et al., 1987; Bachler J. F. et al., 1974; та інших.).

У Росії її дослідження з зазначеним питанням були розпочаті 1974 г. ВНИИЭВ їм. Я. Р. Коваленка під керівництвом професора Сидорова М. А. Можливі цього періоду публікації у вітчизняної літератури з біології гемофильных бактерій, патогенних для свиней, були недостатні для ефективної лабораторної діагностики інфекцій, що викликаються Actinobacillus.

(Haemophilus) A. pleuropneumoniae і H.parasuis. Розробки по діагностики та специфічної профілактиці перелічених хвороб практично отсутствовали.

Мета і завдання исследований.

Вивчити біологічні властивості НАД—зависимых бактерій, викликають генерализованные серозиты і фибринозно — -геморагічну плевропневмонию у свиней. За підсумками результатів таксономического аналізу розробити схему ідентифікації зазначених збудників. Досліджувати можливість специфічної профілактики актинобациллёзной плевропневмонии свиней. Досягнення сформульованих цілей було поставлено такі: Зібрати колекцію штамів НАД—зависимых бактерій, які асоціювалися з серозитами і фибринозно—геморрагическими пневмониями свиней, провести порівняльне вивчення їх фенотипических і генотипических характеристик. Визначити критерії їх диференціації від таксономически своїх близьких і подібних видів бактерій. Вивчити чутливість до H. parasuis і A. pleuropneumoniae різних видів лабораторних тварин із метою вибору лабораторної моделі для діагностики, з’ясування питань пато—и імуногенезу. Досліджувати патогенність A. pleuropneumoniae і H. parasuis для свиней. Вивчити методи серологической ідентифікації виділених культур H. parasuis і A. pleuropneumoniae та його серовариантную структуру. Накреслити й апробувати прискорені методи виявлення антигенів A.pleuropneumoniae. Вивчити можливість специфічної профілактики актинобациллезной плевропневмонии свиней з допомогою инактивированной вакцины.

Наукова новизна работы.

Встановлено этиологическая роль H. parasuis у розвитку генералізованих серозитов і Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae в захворюванні свиней фибринозно—геморрагической плевропневмонией за умов вітчизняних свинарських господарств промислового типу. Ці нозологические одиниці вперше діагностовано в свинарських господарствах России.

Проведено комплексне вивчення фенотипических і генотипических характеристик НАД—зависимых бактерій, виділених від свиней при зазначеної патології. Підтверджено приналежність бактерій классифицируемых раніше як вид Haemophilus pleuropneumoniae до роду Actinobacillus. З нумерического аналізу фенотипических ознак НАД—зависимых культур зібраної колекції виділено феноны, відповідні видам H. parasuis, A. pleuropneumoniae і таксону «мала група» і визначено дифференцирующие ознаки між зазначеними краєвидами та іншими таксонами сімейства Pasteurellaceae. Визначено критерії диференціації культур НАД— незалежного биовара A. pleuropneumoniae від подібних бактерий.

Експериментально обгрунтовані методи серологической ідентифікації культур A. pleuropneumoniae і H. parasuis, і навіть виявлення антигенів A. pleuropneumoniae в тихорєцькому матеріалі. Визначено серотиповая структура НАД—зависимых культур A. pleuropneumoniae і H. parasuis, виділених при відповідної патології свиней.

Вивчена патогенність A. pleuropneumoniae і H. parasuis для лабораторних тварин і звинувачують свиней. Показано значення гемолизинов і екзотоксинів A. pleuropneumoniae для вірулентності збудника і окреслена їх роль патогенезі актинобациллёзной плевропневмонии свиней.

Дано наукове обгрунтування методів лабораторної діагностики гемофилёзов свиней і технології виготовлення инактивированной эмульгированной вакцини проти актинобациллёзной плевропневмонии свиней (авторське свідчення № 907 899 від 21.10.1981 г.), доведено ефективність активної імунізації проти актинобациллезной плевропневмонии свиней за умов неблагополучного хозяйства.

Практична цінність работы.

Розроблені та використовують у ветеринарних діагностичних лабораторіях і свинарських хозяйствах:

— Тимчасові методичні вказівки по лабораторної діагностики гемофилёзного полисерозита поросят. Рекомендовані МСХ СРСР 17.10.1978 г. № 116−18.

— Тимчасові методичні вказівки по лабораторної діагностики гемофилёзного плевропневмонии свиней. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 16.04.1981 г.

— Методичні вказівки з діагностики гемофилёзов свиней. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 02.11.1985 г. № 115−6а.

— Методичні свідчення про виготовлення й застосування їх коагглютинирующего антительного диагностикума для експрес — ідентифікації Гемофилюс плевропневмоние і індикації збудника в патологічному матеріалі. Затверджено відділенням ветеринарії РАСХН 16.02.1993 г.

Тимчасова інструкція про заходи боротьби з гемофилёзами свиней. Затверджено ГУВ МСХ СРСР. 02.11.1985 г. № 115−6а.

Розроблені та утверждены:

— Інструкція із виготовлення та контролю вакцин проти гемофилёзной плевропневмонии свиней. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 11.07.1990 г.

Вакцина проти гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированная. Технічні умови ТУ—10−09−53−90. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 11.07.1990 г.

— Наставляння щодо застосування вакцини проти гемофилёзной плевропневмонии свиней. Затверджене ГУВ МСХ СРСР 11.07.1990 г.

Основні становища, винесені право на захист: Результати комплексного вивчення біологічних властивостей і таксономического становища збудників актинобациллёзной плевропневмонии і гемофилёзного полисерозита свиней, критерії їх диференціації по фенотипическим властивостями від таксономически і екологічно родинних видів бактерій. Методи серологической ідентифікації культур A. pleuropneumoniae і виявлення антигенів збудника в тихорєцькому матеріалі. Принципи виготовлення й лабораторного контролю инактивированной вакцини проти актинобациллёзной плевропневмонии свиней, результати випробування ефективності вакцини в виробничих условиях.

Апробація работы.

Матеріали дисертації було повідомлено на засіданнях ученого та методичного рад Всеросійського науково-дослідного інституту експериментальної ветеринарії їм. Я. Р. Коваленка (1975;1983г.г.), ученого ради ветеринарно — санітарного факультету Московського Державного університету прикладної біотехнології (1984; 1995 г.г.), ветеринарної секції Науково- -технічного ради Міністерства сільського господарства СРСР (23.11.1983г.), на семінарі бактериологов республіканських ветеринарних лабораторій (г.Тбилиси, 1980 г.), на семінарі бактериологов обласних ветеринарних лабораторій РРФСР (НПВЛ РРФСР, 1981 р.), нараді фахівців свинарських комплексів СРСР (м. Москва, ВДНГ, 1980 г.), на наукових конференціях ВНИИЭВ їм. Я. Р. Коваленка (1993 р.), МГАВМиБ їм. До. І. Скрябіна (1991,1996 г.г.).

За матеріалами дисертації опублікована 41 наукові праці, методичні вказівки й красномовні настанови; отримані два авторських свідоцтва на винаходи. Опублікована у співавторстві М. А. Сидоровым монографія «Гемофилёзы тварин» (М., Колос, 1986).

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладено на 552 сторінках машинопису і складається з виведення, двох глав огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, двох глав власних досліджень, обговорення результатів, висновків, практичних пропозицій і докладання. Дисертація містить 82 таблиці, 30 малюнків. Список літератури містить 472 джерела, зокрема 61 вітчизняних і 411 іноземних авторов.

Власні исследования.

1. Матеріали й методи дослідження. Робота виконано у ВНИИЭВ їм. Я. Р. Коваленка і МГУПБ під час 1974—1995 гг. Вжиті дослідження були частиною планової наукової тематики ВНИИЭВ і МГУПБ. Окремі етапи досліджень проведено що з Сидоровим М. А., Шубін В.А., Гумбатовым Ю. К., Мицаевым Ш. Ш., Блему Ж., Силла Ф., Лаврентьєвим Н.І., Романової Л., Суботіним В.В., Пруссак—Глотовым В. Е., Логиновым І.А., Корнелаевой Р.П.

Ряд комплексних досліджень проведено разом із співробітниками лабораторії патологічної анатомії ВНИИЭВ проф. Шубін В.А., Татришвили И. К., Андрышиным О. Н., лабораторії молекулярної біології і біохімії ВНИИЭВ Артюхиным С. К. і Фоміним Б.А.

Діяльність використовували 30 штамів типових культур бактерій сімейства Pasteurellaceae: Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae (серовары 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,), Pasteurella — haemolytica — подібні бактерії, гемофильные бактерії «малої групи», таксони «З», H. influenzae, H. parainfluenzae, H. parasuis (серовары А, В, С, Д), P. multocida (серовары А.В.Д). Також використовували культури S. aureus (шт.№СТС 8530, 209 р.), S. epidermidis (шт.АТСС14 990), S. saprophyticus (шт.2284 ІГ), В. megatherium (прим. № 654), B. subtilis, S. cholerasuis (шт.№ 370), S. typhimurium (шт.№ 415).

Докладному вивченню включаючи нумерический аналіз, підданий 141 штам НАД—зависимых эпизоотических культур бактерій, виділених нами від свиней, і 160 штамів піддані серологической ідентифікації. Бактериологически чи патологоанатомически досліджені матеріали з більш 2200 свиней. Під час вивчення питань патоі імуногенезу використовували 157 свиней, 210 морських свинок, 546 білих мышей.

Для культивування НАД—зависимых бактерій застосовували «шоколадний» агар, бульйон і агар Левинталя, сывороточно- -дріжджової агар і бульйон, кров’яної агар і бульйон з урахуванням МПБ, МПА, бульйону і агару Хоттингера. Як джерела специфічних ростових чинників використовували кристалічний гемин («Реахим»), НАД («Реахим»), дріжджової екстракт, кров різних видів звірів, котрі живлять культури бактерій («баккормилки»). Культивування бактерій в рідких поживних середовищах здійснювали в стаціонарних умовах й у режимі аэрирования (лабораторний ферментер). Морфологічні, тинкториальные, культуральні і ферментативные властивості бактерій досліджували загальноприйнятими методами. У дифференциально—диагностические середовища щодо ферментативної активності додавали НАД і гемин, і навіть використовували СИБ і ПВДЭ—диагностические набори виробництва Горьковського ИЭМ. Особливості колоній вивчали у косопадающем пучку світла з допомогою стереоскопічного мікроскопа МБС—1, (Акатова Н.С., 1966).

Під час проведення нумерического аналізу в кожного дослідженого штами бактерій визначали 57 фізіологічних ознак, показники перетворювали в числову форму, потім з допомогою ЕОМ вираховували коефіцієнт невідповідності за такою формулою [pic] де: a — кількість незбіжних ознак, b — кількість які збігаються позитивних ознак, з — кількість які збігаються негативних признаков.

Отриману матрицю коефіцієнтів піддавали кластерному аналізу з поданням кінцевих даних як дендрограммы, отображающей розподіл штамів по кластерам (фенонам).

Для генетичної характеристики (дослідження проведено що з Артюхиным С. К. і Фоміним В.А.) эпизоотических і референтних штамів ДНК виділяли методом Marmur (1961). Нуклеотидный склад визначали спектрофотометрически з теплової денатурації з допомогою спектрофотометра «Спекорд М-40».

Мічені [pic] препарати ДНК отримуючи з допомогою реакції НІК — трансляції (Маниатис і соавт., 1985). Реакцію ДНК — ДНК гібридизації проводили методом Денхардта (1966). Ступінь подоби нуклеоидных послідовностей ДНК визначали, приймаючи за 100% радіоактивність гомологической реакции.

Під час вивчення антигенної структури бактерій використовували кролячі гипериммунные сироватки на цілісні мікробні клітини. Пробирочную і пластинчатую РА ставили по Mittal K. і співавт. (1984), під час постановки РА з 2 — меркаптоэтанолом (2МЭ) серійні розведення сироватки робили в розчині з 0,1 М -2МЭ. Эритроцитарные антигенні діагностикуми для РНГА готували методом Сидорова М. А. і Агаевой Э. М. Ставили РНГА і враховували результати загальноприйнятим способом. Антительные діагностикуми для реакції коагглютинации готували по Mittal K. і співавт. (1987). Реакцію імунофлуоресценції у двох східчастому варіанті проводили з використанням комерційних мічених ФИТЦ, антикроличьих сироваток і люмінесцентного мікроскопа МЛ — 2.

Реакцію наводили за класичному варіанті, для дослідження свинячих сироваток крові - по Nicolet J. (1971) з додаванням в комплемент сироватки крові великої рогатої скота.

Оцінюючи вірулентності бактеріальних культур визначали [pic]по Ріду і Менну. Залишкову токсичність инактивированных вакцин визначали, використовуючи тест приросту живої маси мишей. При визначенні специфічної активності експериментальних вакцин розраховували [pic], індекс і коефіцієнт ефективності препарату (Безгрошових І.С., Леонтьєва Л.Г., 1969).

Цифровим матеріал обробляли, використовуючи узвичаєні методи математичної статистики (Ашмарин І.П., Воробьёв А. А., 1962; Терентьєв П.В., Ростова Н. С., 1977).

2. Результати исследований.

2.1. Властивості збудників, таксономическое ситуацію і розробка лабораторної діагностики актинобациллёзной (гемофилёзной) плевропневмонии і гемофилёзного полисерозита свиней .

2.1.1. Живильні середовища проживання і культивування A. pleuropneumoniae і H.parasuis.

Конструювання поживних середовищ для культивування A. pleuropneumoniae і H. parasuis передбачає облік потреби даних видів в НАД. Мінімальний рівень зони оптимуму в обох видів бактерій близький і становить 1,8 — 3,6 НАД в 1[pic] середовища. Верхній граничний рівень має видові і штаммовые відмінності, причому він нижчий у H. parasuis (15,62 — 31,25 мкг/[pic]), ніж в A. pleuropneumoniae (250мкг/[pic]) й у своє чергу, він менші надходження до межах виду H. parasuis у свежевыделенных эпизоотических штамів, ніж в адаптованих музейних культур. Отримані дані дозволили обгрунтовано конструювати живильні середовища свинарства урахуванням можливих штаммовых потреб у НАД. З природних джерел НАД найбільш доступний і ефективний дріжджової екстракт. Переживають тварини тканини також містять достатні зростання V — залежних бактерій кількість НАД. Найбільш зручно у разі використовувати кров’яної згусток на агарі Цинссера чи сывороточном агаре.

Випробування різних видів що живлять культур бактерій як продуцентів НАД показало, сто ростовий чинник экскретируют в достатній кількості інтенсивно ростучі види бактерій (эшерихии, сапрофитные бацили, стафілококи), що забезпечують зону від 16,8 ± 0,89 мм до 31,6 ± 1,14 мм залежно від виду бактерій та певного типу живильним среды.

Проте, під час використання культур стафілококів, встановили, що окремі інгібірують сателлитный зростання A.pleuropneumoniae. Не виявили опис подібного феномена, але він відомий у P.multjcida. Але у літературі є повідомлення про наявність гиалуроновой кислоти у складі капсули деяких штамів A.pleuropneumoniae. Отже, причиною ингибиции зростання то, можливо синтез культурою стафілокока гиалуронидазы. Ми теж виключаємо ймовірність утворення продуцентом НАД сполук типу НАД-азы. У кожному разі, яка живить культура бактерій мусить бути попередньо перевірено за вказаною критерию.

Визначення НАД — залежності - важливий етап в ідентифікації A. pleuropneumoniae (1-ї биовар) і H.parasuis. Наші дані про те, що референтні і эпизоотические культури A. pleuropneumoniae періодично можуть втрачати НАДзалежність, причому це ж стосується будь-якого штами 1-го биовара. Явище НАДзалежності може бути відновлене у культур, втратили це властивість, шляхом культивування на «обеднённой» живильним середовищі з локальним джерелом НАД. Отже на звичайних поживних середовищах тваринного походження культури, втративши НАД залежність, утилізують якісь попередники НАД, відсутні, наприклад, в глюкозо-казеиновом агарі. На останньої живильному середовищі їх зростання може бути лише у присутності НАД, залежність від якої вони набувають вновь.

Результати досліджень з вивчення НАД — залежності гемофильных бактерій дозволили нам дати й рекомендувати для практичних цілей поєднання поживних середовищ, які у умовах діагностичної лабораторії тестувати V — і Х — зависимость.

Дослідження засвідчили відсутність СО2 — залежності у вивчених культур H. parasuis і A. pleuropneumoniae, і навіть зірвалася знайти суттєвих відмінностей в частоті ізоляції культур з патологічного матеріалу за умов звичайній атмосфери і підвищеного змісту СО2. Обидва виду бактерій показали сильну залежність від наявності у у живильному середовищі сироватки крові. У H. parasuis ця потреба виражена сильніше, ніж в A.pleuropneumoniae. За відсутності в живильному субстраті сироватки крові обидва виду бактерій швидко диссоциируют.

Кількісні показники, що характеризують зростання A. pleuropneumoniae і H. parasuis в рідкої живильному середовищі (бульйон Хоттингера, 120 мг % аминного азоту, рН 7,6,5,% сироватки крові великої рогатої худоби, 10% дріжджового екстракту), свідчить про більш інтенсивному зростанні першого виду, в частковості, період генерації відповідно становив 40,8 і 67 хвилин, питома швидкість зростання 1,008 і 0,622, приріст бактеріальних клітин за 1 годину культивування 0,44 і 0,27 log.

Оцінка поживних середовищ первинного ізоляції культур H. parasuis і A. pleuropneumoniae (1-ї биовар) показала, для цієї мети може бути використані агар і бульйон Левинталя, «шоколадний» агар, сывороточнодріжджової бульйон і агар, сироватковий і кров’яної агар, з локальними джерелами V — ростового чинника. Краще використання прозорих поживних середовищ, дозволяють отримувати повнішу інформацію про особливості колонії. Використання середовищ з локальними джерелами НАД дає важливу інформацію першому етапі бактеріологічної дослідження щодо НАДзалежності, а разі кров’яного агару — також гемолітичної активності бактерій. Застосування що живлять бактерій як джерела НАД вимагає отвивки культур протягом 24−48 годин через швидкої їх загибелі під впливом метаболітів «баккормилок». Подращивание матеріалу протягом 6−8 годин на сывороточно — дріжджовому бульйоні, що містить бацитрацин, з наступним рассевом на середовища збільшує ймовірність виділення культур НАД—зависимых бактерий.

Задля підтримки культур H. parasuis і A. pleuropneumoniae при поточної роботі у найбільшою мірою підходять оптимальні щільні живильні середовища з заливанням культур вазеліновим олією за нормальної температури зберігання 5−8(С. Найбільш довго зберігають життєздатність (6−7 тижнів) культури, вирощені в згустках крові й збережені в замороженому состоянии.

2.1.2. Методи й одержують результати ідентифікації НАД—зависимых бактерій, виділених від свиней, по культурально — морфологічним, ферментативным і генетичним свойствам.

Дослідження ферментативних властивостей НАД — і гемин — залежних культур бактерій проводили на рутинних дифференциально-диагностических середовищах з додаванням ростових чинників, і навіть на рідких середовищах Гисса в микрообъёмах і діагностичних системах ПБДЭ і СИБ Горьковського НИЭМ. Максимальне збіг результатів отримали на загальноприйнятих середовищах, в ПБДЭ і микрообъёмах.

Таксономическое становище 165 культур НАД—зависимых бактерій, виділених від клінічно здорових свиней, і навіть тварин із явищами фибриозно-геморрагической плевропневмонии чи генералізованих серозитов, було досліджувана з допомогою нумерического аналізу. Як опорних в цю колекцію культур було включено типові штами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, H. parasuis, H. parainfluenzae, H. influenzae, A. ligieresii, A.suis. Кожен дослідженого штами були визначено 57 фенотипических ознак, характеризуючих їх культуральні і ферментативные властивості. Усі отримані дані були перетворені на числову форму, піддані нумерическому аналізу свинарства кінцевим поданням отриманих успіхів у вигляді дендрограммы.

Аналіз дендрограммы показав, що це культури об'єднують у єдиний масив за 23−24-відсоткового рівня подібності 75,02%, після що вони поділяються на два великих фенона: сам із рівнем подібності 81,87%, до складу якого типові штами A. lignieresii, A. suis, Haemophilus, (Actinobacillus), pleuropneumoniae і типовий штам «малої групи» (фенон «А»), другий з рівнем подоби 81,997% включає типові штами H. influenzae, H. parainfluenzae і H. parasuis (фенон «М»). З фенона «А», що об'єднує культури актинобацилл лише на рівні подоби 91,23%, виділяється фенон № 1, до складу якого види A. lignieresii і A. suis, і рівні подібності 95,00% виділяється фенон № 2, який би эпизоотические культури навколо типового штами «малої групи». За сьогоднішнього рівня подоби 89,48% формується фенон № 3, який би эпизоотические штами навколо типових культур Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.

У феноне «М» лише на рівні подібності 81,997% виділяється фенон № 4- -H.influenzae, лише на рівні 87,63% - фенон № 5, який би штами H. parainfluenzae на рівні подоби 89,60% навколо типових штамів H. parasuis концентрується інша група эпизоотических штамів — -фенон № 6.

Отже, масив эпизоотических штамів диференціюється втричі фенотипічні групи, відповідні видам Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, H. parasuis і «малої групі» гемофильных бактерій. Отримані дані свідчить про тяжінні культур Haemophilus pleuropneumoniae немає роду Haemophilus, а до роду Actinobacillus.

З метою уточнення таксономического становища эпизоотических штамів, класифікованих по фенотипическим властивостями як Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, НАД—зависимых бактерій, які охоплюють як Pasteurella-haemolyticaподібні бактерії, був визначено нуклеотидный склад парламенту й рівень гомології ДНК культур цих груп свинарства представниками роду Haemophilus (H.parasuis, шт. J 95-таксон «З»), Pasteurella (P.multocida), Actinobacillus (A.suis), ні з типовими культурами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.

Результати обстеження засвідчили, що це досліджені штами по ГЦскладу утворюють досить однорідну групу свинарства крайніми значеннями 39,8 — 43,2 ([pic]=41,3(0,2). Такі значення цілком відповідають процитованими в Керівництві Берги для сімейства Pasteurellaceae. Трохи більше високий ГЦ складу виявлено у P. haemolytica — подібних бактерій (42,5(0,5) по порівнянню з типовими штамами A. pleuropneumoniae, (40,7(0,5). Эпизоотические штами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae мали показник 41,2(0,1 мовляв% ГЦ.

Рівень гомології ДНК всередині групи P. haemolytica — подібних штамів становив 100%; ДНК-бактерій цієї групи (шт.2288/77) мала гомологию з ДНК типових штамів A. pleuropneumoniae — 75%; з ДНК A. suis — 33%, з ДНК P. multocida і H. parasuis трохи більше 9%; з ДНК эпизоотических штамів Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae — 75—83%.

Эпизоотические штами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae за даними гібридизації ДНК утворюють генетично взаємозв'язану групу з рівнем подоби нуклеотидних послідовностей — 75−100%. У той самий час бактерії цієї групи тісно пов’язані з типовими штамами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae (78−98%), лише на рівні 33−38% гомологичных нуклеоидных послідовностей з ДНК A. suis, і лише з рівні гомології ДНК 5−9% з H. parasuis і 3−10% з P.multocida.

При інтерпретації отриманих результатів ми виходили із критеріїв генетичного аналізу, запропонованих Медниковым і соавт.(1974), відповідно до яким культури P. haemolytica — подібних бактерій які мають НАД—зависимости, можна розглядати як биовар Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae. У цілому нині эпизоотические штами, виділені при фибринозно — геморагічних пневмоніях, P. haemolytica — подібні бактерії і типові штами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae постають як видова спільність із відчутною внутрішньовидовий гетерогенністю. Такий внутрішньовидовий рівень гетерогенності виключає виділення додаткових внутривидовых таксонов, крім НАД—зависимого і - незалежного биоваров.

Отримані дані свідчать, що культури A. pleuropneumoniae, обозначаемые в 9-му виданні Керівництва по систематики бактерій Берги як видів роду Haemophilus, не ставляться щодо нього, і навіть штам J95 (таксон «З»), згадуваний у числі видів роду Haemophilus, за даними гібридизації теж належить до роду Haemophilus.

З результатів нумерического аналізу, з урахуванням частоти народження тих чи інших позитивних ферментативних реакцій, для ідентифікації НАД—зависимых бактерій, виділених при пневмоніях і генералізованих серозитах свиней, рекомендовані як основних диференційних ознак (крім культуральних): НАД—зависимость, освіту уреазы, лужної фосфатазы, гемолизина, кислоти з ксилози, маннита і маннозы. Інші ферментативные ознаки так можна трактувати як дополнительные.

Втрата культурами A. pleuropneumoniae НАД—зависимости і визнання існування НАД—независимого биовара цього виду бактерій робить неприйнятною схему ідентифікації, запропоновану для НАД—зависимых культур. Неминуче розширюється число бактеріальних видів, яких необхідно диференціювати НАД — незалежні культури A.pleuropneumoniae. Ситуація ускладнюється тим, що подібні патологоанатомічні зміни у легких можуть викликати решта видів бактерій. Досліди експериментального (интраназального) зараження свиней подібних змін у легенях знайшли при инокуляции культур A. pleuropneumoniae НАД—зависимого і - незалежного биоваров, A. suis і бактерій «малої групи». Ця обставина збільшує значення бактеріологічної дослідження, у діагностиці хвороби. Порівняльне вивчення фізіологічних властивостей A. pleuropneumoniae (1 і 2 биовары), A. suis, P. multocida і B. bronchiseptica як видів подібних і часто які виявляються при пневмоніях свиней дало змогу відібрати їхнього диференціації наступний мінімальний набір ознак: липкість колоній і в’язкість бульйону, наявність капсули і жгутиков, гемолитическая і уреазная активність, освіту лужної фосфатазы, індолу, кислоти з маннита, сорбита, салицина, мелибиозы, утилізації цитратов.

3. Патогенні властивості A.pleuropneumoniae.

Дослідили патогенність цього виду бактерій для лабораторних тварин і звинувачують свиней.

При випробуваннях різних способів зараження морських свинок культурами A. pleuropneumoniae тварини цього виду виявилися найчутливіші культур интраназальной инокуляции (ЛД50=125млн.м.к.), менш чутливі - до внутрибрюшинному (ЛД50=1,585 млрд.м.к.) і малочувствительны до подкожному зараженню. Порівняльна оцінка вірулентності дев’яти штамів A. pleuropneumoniae при интраназальном способі инокуляции критерієм обсягу поражённой лёгочной тканини показала найбільшу вірулентність культур 1,4,5 сероваров й суттєво меншу у культури серовара 3; культури серовара 2 показали штаммовые відмінності. Патологоанатомічні зміни при интраназальном зараження морських свинок характеризувалися розвитком фиброзно-геморрагической пневмонии.

На відміну від морських свинок білі миші виявилися чутливі до внутрибрюшинному зараженню: ЛД50 становила для культури [pic] [pic] [pic] зміни у легких у заражённых мишей характеризувалися розвитком геморагічної пневмонії. Відмінною рисою стало практично повну відсутність відкладень фібрину на плевру і перикарде. У цілому нині простежується видові відмінності змін — у легких при актинобациллёзной пневмонії: в запальному экссудате якомога більше фібрину відзначається у свиней, менше — у морських свинок та практично відсутня у мышей.

Отримані результати свідчать, що морські свинки і білі миші можна використовувати як лабораторної моделі щодо вірулентності штамів збудника, питань пато — і иммуногенеза.

Випробування різних способів зараження 2−2,5 — місячних свиней показав їх чутливість до интраназальному і трахеальному способам запровадження збудника при опірності підшкірній инокуляции культур. Захворювання вдалося також відтворити контактним шляхом. При интраназальном і трахеальном зараження (доза [pic]) інкубаційний період становив 3 — 6 годин, контактному — 72 години. За всіх засобах зараження однотипні зміни у вигляді фибринозно — геморагічної пневмонії відзначали в легких. Це говорить, що природними вхідними воротами збудника є дихальні пути.

Оцінюючи патогенності для свиней культур збудника різних сероваров (сірий. 1,2,3,4,5) встановили, що коливання вірулентності більше відбивають штаммовые відмінності чи стан культури на даний момент дослідження, ніж серовариантную приналежність. Тільки культура серовара 3 в дослідах на свинях і лабораторних тварин закономірно показувала меншу вірулентність, ніж штами інших сероваров. Титрация культури епізоотичного штами збудника на свинях (интраназальное зараження) показала ЛД50 лише на рівні [pic] м.к.

На результати зараження свиней впливає вік культури бактерій. При интраназальном зараження свиней однаковою дозою 6 — і 18 — вартових культур ([pic]) інкубаційний період, відповідно, становив 3 і аналогічних сім годин, середнє період від зараження до загибелі тварин — 48,5 і 103 години, кількості смертей -100% і 50%, обсяг поражённой лёгочной тканини — 70% і 47,5%, що свідчить про різною вірулентності культури штаму на різних стадіях розвитку популяции.

Крім властивостей заражающей культури збудника на протягом десятиліть і результат хвороби впливають чинники довкілля. Під час експерименту показано значення чинників мікроклімату. Дванадцять заражённых однієї культурою свиней містили за умов мікроклімату, відповідного зоогигиеническим нормам, (група А) і свинарства відхиленнями (група Б). У групах Проте й Б відповідно всього впала 66,6% і 100% свиней, їх у перебігу 24 годин — 33,3% і 66,6%. Середнє період від зараження до загибелі у групах становило 67,5 і 27,3 години. Обсяг поражённой лёгочной тканини — 32,2(12,1% і 59,5(5,9%. Відмінності за показником в групах Проте й Б статистично достовірні (р (0,01).

Досліди експериментального відтворення актинобациллёзной пневмонії на морських свинках, свинях, і навіть для дослідження тварин, полеглих за умов неблагополучного господарства, досліджували диссеминация возбудителя.

При летальний кінець у свиней найчастіше культури збудника ізолювали з уражених ділянок лёгочной паренхіми (100%), бронхіальних і средостенных лімфатичних вузлів (63,33 — 100%), рідше — з печінки, селезёнки, нирок, кісткового мозку, крові, мозку. Отримані дані визначають характер матеріалу, отбираемого для бактеріологічної исследования.

Дослідження експериментально заражённых морських свинок (интраназальная щеплення) показало, що у легких як осередкової гиперемии у зоні розгалужень великих і середніх бронхів розвиваються вже годину після инокуляции культури. Збудник цього стадії реизолировали з лёгочной тканини, бронхів, трахеї. Три години на легких розвивалися типові зміни. І на цій стадії в 25% випадків культури збудника реизолировали з крові й паренхіматозних органів. Після закінчення 6 годин зміни у легких отримали повне розвиток. Отже, бактериемия і диссеминация збудника відбувається і натомість вже наявних змін — у лёгких.

Спостереження за експериментально заражёнными хворими свинями в умовах неблагополучного господарства дозволяють виділити три варіанта течії хвороби: сверхострое, гостре і подострое. При надгострий перебігу і натомість жорсткого респіраторного синдрому летальний кінець настає протягом 6−24 годин. У у грудній порожнині, де є поражённые частки легенів, виявляли 150−300см3 червонястій рідини, изменённая частка легенів збільшена обсягом, тканину на розрізі тёмно-красного кольору, интерлобулярные септы отёчны, консистенція поражённой тканини щільна, з розтину стікає червоняста рідина, бронхи і трахея заповнені аналогічної пінистої рідиною. Відкладення фібрину на пульмональной і костальной плевру отсутствуют.

У тварин із гострим течією хвороби відзначений прогресуючий респіраторний синдром на підвищення температури до 40,6—41(C, що завершується смертю протягом 6—7 діб. У полеглих свиней у грудній порожнини знаходили до 200 см³ червонуватої рідини з пластівцями фібрину. Поражённые легені тёмно-красные, щільні, ламкі, з вираженим отёком междольковой сполучної тканини. Костальная і лёгочная плевра вкриті плёнками фибрина.

У свиней з подострым течією реєстрували симптоми пневмонії, лихоманку ремитирующего типу, погану поедаемость корми. Поражённые частки легких збільшено, горбисті, щільні, нерівномірно вирізняються: ділянки тёмночервоного, сіро-коричневого, грязно-бурого кольору. Через 15−20 днів, у лёгочной тканини виявляли осередки ущільнення, оточені сполучної тканиною. Відкладення фібрину на лёгочной і костальной плевру пронизані сполучної тканью.

Гістологічні зміни у легких у початковій стадії хвороби можуть бути охарактеризовані як бактеріальний токсичний шок (Гістологічні дослідження проведено д.в.н. Шубін В.А.) Типовим для органопатологии бактеріального шоку вважається парез і стаз артериол, дрібних артерій, набухання і фибриноидный некроз стінок. Приєднання внутрисосудистого згортання крові саме й надає шоку незворотного характеру і призводить культур виникненню некрозів тканини. Подальші зміни розвиваються на зазначеному тлі. На 2−3 добу починається інфільтрація уражених тканин мононуклеарными клітинами, переважно лимфоцитами, за відсутності чи малому кількості нейтрофилов, ці клітини формують своєрідний демаркаційний вал. Пізніше уражених тканинах розвиваються некротические осередки, котрі піддаються инкапсуляции. Залежно від ходи хвороби та термінів загибелі тваринного можна знайти та чи інша стадія патологічного процесса.

Підтвердженням виведення про провідну роль токсинів в патогенезі актинобациллёзной плевропневмонии є такі результати наших досліджень. Встановлено, сто в періодичної аэрируемой культурі збудник у перших 3 години культивування синтезує термолабильные, чутливі до трипсину гемолизин і экзотоксин. Динаміка їх нагромадження і інактивації в культуральної рідини, що містить гемолизин і экзотоксин, викликає в морських свинок в легких зміни типові для актинобациллёзной пневмонії. На думку, 6−8- годинникові агаровые і трьохгодинникові бульйонні аэрируемые культури у фізіологічному відношенні близькі, оскільки знаходяться у початковій стадії логарифмічного зростання. Тому ми вважаємо, що у першому етапі розвитку змін — у легких визначальну роль грають гемолизин і экзотоксин. На думку, 6−8- годинникові агаровые культури збудника містять не певна кількість в пов’язаному вигляді гемолизина і экзотоксина, який визначає велику вірулентність молодих культур.

4. Патогенні властивості H.parasuis.

Досліджували чутливість в збудника морських свинок, білих мишей, поросят-отъёмышей.

ЛД50 культури H. parasuis штам № 1 для морських свинок при интраназальном зараження становила 354 млн.м.к., внутрибрюшинном — 594 млн.м.к., підшкірному — 1,414 млд.м.к. За всіх засобах зараження з різної частотою виявляли розвиток серозно-фибринозного плевриту, перитоніту, рідше перикардита. Після интраназальной инокуляции у 100% тварин відзначали розвиток катаральной пневмонії. У полеглих тварин культури збудника найчастіше виділяли з уражених серозних оболонок і рідше — з паренхіматозних органов.

ЛД50 культури H. parasuis при внутрибрюшинном запровадження штами серовара З становила [pic], [pic], [pic], [pic]. Білі миші, як і морські свинки були чутливі до внутрибрюшинному (ЛД50=1,414 млрд.м.к.) і интраназальному (ЛД50=1,549 млрд.м.к.) способам зараження при стійкості до подкожному запровадження культури. Патологоанатомічні зміни у мишей і морських свинок були однотипны.

З нашою погляду, морських свинок можна як найбільш зручну модель для біопроби і вивчення пато — і імуногенезу інфекції, спричиненої H.parasuis.

Досліди на поросятах-отъёмышах показано, що гемофилёзный полисерозит то, можливо воспроизведён при интраназальном, трахеальном, внутрибрюшинным і внутрішньовенному запровадження культури H.parasuis. З огляду на екологію збудника, можна буде усвідомити, що природними вхідними воротами інфекції є дихальні шляху. При трахеальном зараження перші клінічні симптоми як гноблення і підвищення температури тіла відзначаються через 6−8 годин, пізніше (20−24 години) в абсолютної більшості тварин розвивається катаральна пневмонія. У 75% випадків вже в цієї стадії розвивається серозно-фибринозный плеврит й у 50% випадків — перитоніт, що свідчить про високих інвазивних властивості збудника. У тварин, убитих через 24 години після зараження, і натомість описаних патологоанатомічних змін культури збудника були виділені 100% випадків із легких і бронхіальних лімфатичних вузлів й у 25% випадків — з крові. У пізні терміни суттєвих змін у характері патологоанатомічних змін не наставало, крім резорбції экссудата з порожнин і чекає появи в окремих тварин симптомів поразки суглобів кінцівок головного мозку. Гістологічні дослідження (виконані д.в.н., професором Шубін В.А.) дозволяють охарактеризувати зміни у експериментально заражённых і, природно хворих свиней як септико-токсический процес із поразкою серозних покровів, паренхіматозних органів, лімфатичних вузлів і центральної нервової системы.

Дослідження засвідчили, що типові патоморфологічні зміни можуть викликати як капсулообразующие, і бескапсульные форми збудника при більшої вірулентності первых.

За даними зміни у легких, плевру, перикарде і перитонеуме асоціюються з локалізацією у яких збудника. Частота ізоляції культур H. parasuis з тканин та органів залежить від характеру хвороби та давності процесу. При гострому перебігу внаслідок експериментального (трахеального) зараження через 48−72 години з легких культури збудника виділили в 100% випадків, плеври — 75%, перитонеума і перикарда -25%, бронхіальних лімфатичних вузлів — 100%, селезёнки — 50%, крові - 25% випадків. При бактеріологічному дослідженні поросят, полеглих з картиною гострого полисерозита, мови у природничих умовах культури збудника виділили з легких у 42,85%, перикарда — 92,2%, плеври — 71,42%, печінки — 57,14%, селезёнки — 66,66% тварин. У віддалені терміни після експериментального зараження і зажадав від тварин, полеглих мови у природничих умовах з картиною подострого полисерозита, збудник виділяли рідше і з плеври, легких, перикарда, перитонеума і средостенных лимфоузлов.

Аналіз вікової захворюваності поросят гемофилёзным полисерозитом показав, що пік відходу посідає вік 35−60 днів. Поява відходу поросят з ознаками гемофилёзного полисерозита збігається з зниженням титру колостральных антитіл до H. parasuis (серовар Д), збільшенням рівня колонізації збудника в респіраторному тракті. За даними, H. parasuis є дуже звичайним компонентом нормальної мікрофлори слизових колій та і натомість описаних змін, поряд з іншими этиологическими агентами, бере участь у виникненні пневмоній у поросят цієї вікової групи й низка випадків це супроводжується розвитком септичної стадії із поразкою серозних оболонок, суглобів головного мозга.

2.1.5.Обоснование критеріїв відбору матеріалу для бактеріологічної дослідження на актинобациллёзную пневмонію і гемофилёзный полисерозит.

Гемофилёзный полисерозит. Дані про диссеминации збудника свідчить про найбільшої частоті його виділення з уражених серозних оболонок, серозно-фибринозного экссудата. Виділення чистої культури збудника найімовірніше для дослідження пунктата з уражених суглобів і перикарда. У замороженому патологічному матеріалі H. parasuis зберігає життєздатність до 30 діб (режим зберігання -18©.

Актинобациллёзная плевропневмонія. Незалежно від характеру течії хвороби збудник закономірно знаходять у поражённой тканини легких і регионарных лімфатичних вузлах, який визначає характер матеріалу, отбираемого для бактеріологічної дослідження. У патологічному матеріалі, заключённом в водно-глицериновую суміш (температура зберігання 4 —6©, збудник зберігає життєздатність протягом 15 діб, в замороженому тихорєцькому матеріалі - до 45 суток.

6. Серологічна ідентифікація культур H.parasuis.

A.pleuropneumoniae.

7. Методи і вивести результати серологической ідентифікації культур

H.parasuis.

Використовували кролячі гипериммунные сироватки проти типових штамів сероваров А, У, З, Д.

Диференціація сероваров H. parasuis в пробирочной РА показала її малу специфічність. Ефективнішою для зазначеної мети виявилася РСК з розчинними антигенами.

Дослідження в РСК з типовими сироватками 46 эпизоотических культур H. parasuis, виділених при генералізованих серозитах, дозволило 47,82% культур зарахувати до відомим сероварам Бакоса. Штами серовара, А склали 15,2%, У — 17,39%, З — 2,17%, Д-13,04%. Серед опитаної штамів, виділених з легких при пневмоніях (18шт), культури серовара, А склали 16,6%, У — 11,1%, З — 5,56%, Д -33,3%, нетипируемые -33,3%. Серед культур, виділених з носовій слизу клінічно здорових свиней (14 прим.), 35,7% віднесено до серовару А, 14,2% — до серовару Д, зірвалася типировать 50% штаммов.

Загалом в всієї групі із 78 штамів H. parasuis було віднесено до серовару, А — 19,23%, У — 12,82%, З — 2,56%, Д — 17,95%, нетипируемые культури склали 47,44%.

Дослідження нетипируемых культур в РСК свинарства атисыворотками проти ізоляторів цієї категорії показало наявність ще трьох сіркологічних варіантів і частина культур залишилася поза цих груп. Отримані дані дозволяють укласти, що необхідно розширення числа сероваров з урахуванням схеми Бакоса, або потрібно створення нової схеми серовариантной диференціації з новими типовими штаммами.

Аналіз серотиповой структури культур, виділених у межах господарства показав асоціацію з генерализованными серозитами свиней H. parasuis різної серовариантной принадлежности.

2.1.6.2. Методи й одержують результати серологической ідентифікації культур A.pleuropneumoniae.

Для серовариантной диференціації культур A. pleuropneumoniae відчували РА пробирочную, РА з 2-МЭ, РА на склі, РНГА, РНГА з 2-МЭ, РКА пробирочную на склі, двоступеневу РИФ. При внутрішньовидовий диференціації у різних сіркологічних реакціях типових культур A. pleuropneumoniae (серовары 1,2,3,4,5,6,7,8, 10,12) встановлено перекрёстные реакції між сероварами 3,6 і побачили 8-го, 2 і трьох, 1 і 2, 4 і аналогічних сім. Дослідження двосторонніх антигенних зв’язків здебільшого дозволяє визначити серовариантную приналежність культур. Групу прискорених сіркологічних реакцій для серологической ідентифікації найбільш перспективна РКА з розчинними антигенами.

При серологической ідентифікації 82 эпизоотических НАД—зависимых культур бактерій, виділених при фиброзно-геморрагических пневмоніях свиней і класифікованих як A. pleuropneumoniae віднесено до серовару 2 -12,9%, 3 -14,53%, 4 -8,53%, 6 -3,65%, бактеріям «малої групи» -7,31%. Велику групу штамів серологически ідентифікувати зірвалася. Культури останньої групи мали антигенное кревність із сероварами 3,6,8,10, але за дослідженні в перекрёстной РА з адсорбцией були ідентичні им.

2.1.7. Результати вивчення широти поширення сероваров A. pleuropneumoniae виходячи з сіркологічних исследований.

Було зроблено спробу оцінку циркуляції різних сероваров A. pleuropneumoniae в свинарських господарствах жодній області центральної Росії з результатам сіркологічних досліджень. У РНГА досліджували 639 сироваток крові свиней на десяток господарств. Встановлено переважання антитіл до сероварам 1,4,6,3,2,12. При бактеріологічному дослідженні у цьому регіоні культур сероваров 1 та дванадцяти не виділяли. Причини цій ситуації вимагають вивчення. У сыворотках крові деяких серопозитивных свиней пощастило виявити нейтралізують антитіла до гемолизинам A. pleuropneumoniae, що свідчить про наявності певного імунітету до A.pleuropneumoniae.

2.1.8. Розробка й апробація прискорених сіркологічних методів виявлення антигенів A. pleuropneumoniae в патологічному материале.

Для виявлення антигенів A. pleuropneumoniae у тихорєцькому матеріалі було випробувано реакції коагглютинации (РКА) і двоступінчастої імунофлуоресценції (РИФ).

Досліди показали, що РКА можна використовувати для видовий і серотиповой ідентифікації A.pleuropneumoniae. Серотиповую специфічність результатів РКА вдається підвищити шляхом зменшення дози сироватки для сенсибілізацію носія та використання у реакції розчинних капсульных антигенів. Більше активні видові діагностикуми вдалося сконструювати при використанні поливалентных сироваток, отримані від кроликів, иммунизированных не моноантигенами, а сумішшю антигенів A. pleuropneumoniae різних сероваров. Використання РКА як методу видовий ідентифікації зажадало з’ясування міжвидових антигенних зв’язків A.pleuropneumoniae. Вивчали антигенное кревність цього виду бактерій з A. suis, A. lignieresii, P. multocida (А, В, Д), H. parasuis (A, B, C, Д), B. bronchiseptica, S. cholerasuis, S.tiphimurium. Найбільш виражене антигенное кревність встановлено з A. suis і A. lignieresii, наявність що у досліджуваному матеріалі можуть стати хибнопозитивні результати РКА.

Серовариантную диференціацію типових культур A. pleuropneumoniae проводили в РИФ з граничними разведениями антисывороток першому місці, забезпечують світіння клітин свинарства гомологичными реагентами на чотири хреста. Виявили перекрёстные реакції сероваров 1 і 2, 2,3 і шість, 3,2,6 і побачили 8-го, 4 і аналогічних сім, 10 та дванадцяти. Отже, надёжной серовариантной диференціації часом домогтися зірвалася. Слабкі перекрёстные реакції інтенсивністю на два хреста було з культурами A. suis, A.lignieresii. Не зазначено перекрёстных реакцій з P. multocida (А, В, Д), H. parasuis (А, В, С, Д), E. coll, S. cholerasuis і S.tiphimurium.

Під час вивчення специфічності РКА як методу виявлення антигенів збудника органів і тканинах досліджували супернатанты тканинних (лёгочных) гомогенатов клінічно здорових свиней, морських свинок й одержали неспецифічні уповільнені позитивні реакції. Для усунення неспецифічної аглютинації стафилококковые антительные діагностикуми додатково обробляли нормальної кролячої сироваткою, збільшували концентрацію альбуміну в диагностикуме, прогрівали досліджуваний матеріал при 100(С (10,60 хв.) 120(С (15 хв.). Ефективної виявилася термічна обробка матеріалу. Необхідність прогрівання досліджуваного матеріалу змусила розглянути вплив цієї чинника на антигени збудника. Відомо, що різні клітини A. pleuropneumoniae містять специфічні термостабильные і - лабильные антигени (K.Mittal et al., 1987). Вивчення цього питання показало, що у термостабильности антигенів культури можна підрозділити на групу термоустойчивых (сер.2,3,6,8,10) і термолабильных (сер.1,7, штам 202). У культур останньої групи під час кипіння (60 хв.) знижувалася активність антигенів в сіркологічних реакціях, особливо антигенів серовара 1 (шт.ССМ5869). Прогрівання антигенів A. pleuropneumoniae при 100(С протягом 10 хвилин на серологической активності антигенів збудника, крім серовара 1 не сказывается.

Можливість виявлення антигенів збудника в тихорєцькому матеріалі (легені), з допомогою РКА і РИФ спочатку вивчали на морських свинках, білих мишах і свинях, заражённых культурами A. pleuropneumoniae, і навіть A. suis і гемофильными бактеріями «малої группы».

Результати досліджень показали збіг даних бактеріології РИФ і РКА. Слабкі позитивні реакції отримано з тканевым матеріалом, що містить A.suis.

При дослідженні лёгочной тканини від 78 свиней з ознаками пневмонії з 29 матеріалів виділили мікоплазми, з 15-тистафілококи чи стрептококи, змін 16 — P. multocida, з 2 — P. multocida і гемофильные бактерії «малої групи», з 7 — гемофильные бактерії «малої групи», з 9 — S.cholerasuis. За наявності патологічному матеріалі P. multocida у двох випадках отримано позитивні результати РКА з диагностикумом проти штами № 202 («мала група»), не подтверждённые даними бактеріології. У інших випадках для дослідження матеріалів, містять вищезазначені гетерологичные види бактерій результати РКА і РИФ негативними. У дев’яти випадках ізоляції культур «малої групи» дані бактеріологічних досліджень, РКА і РИФ совпали.

Отримані дані дозволяють оцінити РКА і РИФ як досить специфічні і чутливі методи виявлення антигенів A.pleuropneumoniae. Перевагою РКА є можливість дослідження довго хранившегося матеріалу і виявлення розчинних антигенов.

2.2. Розробка і випробування експериментальних зразків инактивированной вакцини проти актинобациллёзной плевропневмонии свиней.

Вікова захворюваність свиней актинобациллёзной плевропневмонией диктує необхідність вакцинації просят-отъёмышей і проблему реактогенності препарату актуальна. Дослідження залишкової токсичності инактивированных цельноклеточных суспензий A. pleuropneumoniae у тісті приросту маси мишей показало високі її рівні. З випробуваних способів інактивації найбільш ефективним виявилася обробка формальдегідом (0,2%) із наступною витримкою бактеріальних суспензій при 4−6(С протягом 30−45 діб. Відмінності порівнюваних показників у цій препарату, і навіть инактивированных 0,1% формальдегіду і тиомерсалом були достовірні, лише на рівні значимості від Р (0,01 — до Р (0,05 (залежно від термінів зберігання). Отримані дані були враховані в технології виготовлення инактивированной эмульгированной вакцини. Випробування вакцини подібного типу на 21,38 — 40 — денних поросятах і супоросных свиноматках показало її безвредность.

Як лабораторних моделей випробування специфічної активності инактивированной вакцини було випробувано морські свинки живої масою 200—250г і білі миші живої масою 14−16г. Мишей вакцинировали підшкірно, дворазово з інтервалом 10 діб в дозі [pic] з наступним визначенням ЛД50 заражающей культури на вакцинованих і контрольних тварин («внутрішньочеревна модель»). ЛД50 культури, встановлена вакцинованих тварин в 5 разів, перевищувала хоча б показник, отриманий на контрольних животных.

Морських свинок акціонували одноразово різними дозами вакцини з наступним интраназальном зараження гомологичной культурою в дозі [pic] («лёгочная модель»). Такий методичний підхід дозволив визначити ИМД50 вакцини. На думку, «лёгочная модель» краще, оскільки його відповідає природним вхідних воріт збудника інфекції. З іншого боку, про ефективність імунізації можна додатково судити наявністю поразок в легких їх масивності. Певну інформацію дають показники серологического відповіді - між обсягом поражённой лёгочной тканини і среднегрупповыми титрами антитіл (РСК) встановлено функціональна зворотна залежність [pic].

Дослідили вплив типу адъюванта на імунологічну ефективність инактивированной вакцини. Як адъювантов використовували гідрат окису алюмінію і масляний ад’ювантна з урахуванням легенів мінерального олії. Эмульгированной вакциною прищепили 315 поросят (полсектора) в неблагополучному по актинобациллёзной плевропневмонии господарстві, 317 свиней цього ж сектора служили контролем. Гидроокисьалюмінієву вакцину запровадили 647 поросятам, контролем служили 652 тварин. Спостереження тварин вели протягом 86 днів, захворювання свиней актинобациллёзной плевропневмонией обсервували під всіх групах. Індекс і коефіцієнт ефективності эмульгированной вакцини в цьому досвіді становив відповідно 7,95 і 8,42%. Аналогічні показники у групі свиней щеплених РВА вакциною були відповідно 3,12 і 67,98%, що свідчить про більшої ефективності эмульгированной вакцини. При конструюванні инактивированной вакцини, з даних про накопиченні в культуральної рідини экзотоксина, гемолизина і капсульной субстанції, досліджували вплив розчинних антигенів бульйонних культур на її імуногенність. У досвіді на білих було визначено ИМД50 эмульгированной вакцини приготовленою з урахуванням бульйонних культур і відмитих клітинах збудника. ИМД50 вакцини першого типу становила [pic] мікробних клітин, у вакцини другого типу ИМД50 зірвалася розрахувати, оскільки відсоток захисту при обраних дозах вакцини не перевищив 36,36%. Отже, включення розчинних компонентів реакторних культур збудника у складі инактивированных вакцин необходимо.

При відпрацюванні оптимальної схеми імунізації свиней инактивированной эмульгированной вакциною досліджували вплив кратності її запровадження на рівень імунітету у свиней. У випадку свиням (8 голів) вводили [pic] вакцини одноразово, за його відсутності - дрібно 1 и2 [pic] інтервалом 10 діб (8 голів). Свиней заразили через 20 днів після вакцинації интраназально в дозі [pic] Встановлено, що з свиней, вакцинованих дворазово, смертей був. З-поміж щеплених одноразово загинуло 50% тварин. Між тваринами цих груп також виявлено достовірна різниця по висоті титрів антитіл (РА). Виходячи змін даних можна укласти, що результати сіркологічних реакцій можуть бути непрямим груповим показником формування иммунитета.

Досліджували вплив сумарною дози антигену при дворазовою (інтервал — 15 діб) вакцинації свиней эмульгированной вакциною на стан імунітету. Встановлено, що з щеплених різними дозами вакцини свиней (16 голів) при контрольному интраназальном зараження [pic] летальних фіналів був, у контролі загинуло 50% тварин. Серед тварин, щеплених вакциною в сумарних дозах 10,6,4 і 2 [pic], обсяг поражённой лёгочной тканини у середньому групам відповідно становив 5,25(6,70, 5,94(8,01, 5,69(10,24, 10,50(8,57%. У контрольних свиней було вражено 25,1% лёгочной тканини. Відмінність титрах комплементсвязывающих антитіл у вакцинованих тварин перелічених груп перед зараженням були статистично не достовірні, теж достовірні відмінності за обсягом поражённой лёгочной тканини. Свинарства урахуванням захворюваності, кількості смертей і обсягу поражённой лёгочной тканини ми вважаємо оптимальної дозу вакцини 4 [pic] [pic], введённую за схемою 1+3 [pic].

Досліджували терміни формування та тривалість імунітету у свиней, щеплених однократних эмульгированной вакциною в дозі 5[pic] із контрольним интраназальным зараженням через 10, 30 і 60 днів після імунізації. Виходячи з рівні захисту вакцинованих тварин зазначених груп, і площі поражённой лёгочной тканини, близькі показники стану імунітету мали свині через 10 і 30 днів із зниженням до 60 дня після вакцинації. Між показниками захисту (%) й площі поразки лёгочной тканини виявлено зворотна функціональна залежність (r= -1). Значна захворюваність свиней актинобациллёзной плевропневмонией у період відгодівлі в неблагополучному господарстві, з урахуванням даних, свідчить про необхідності ревакцинації свиней під час передачі на откорм.

Визначення імуногенності вакцини в дослідах на білих мишах у процесі збереження за 4−6(С показало, що у інтервалі 1−11 місяців ИМД50 препарату коливалась у межах [pic] мікробних клітин, що дозволяє казати про малому зміні активності препарату в зазначені сроки.

З урахуванням результатів випробування різних типів инактивированных вакцин на лабораторних тварин і звинувачують свинях було проведено апробація експериментальних зразків вакцин проти актинобациллёзной плевропневмонии свиней в виробничих условиях.

Спочатку эмульгированная вакцина випробували на нешкідливість і імунологічну ефективність обмеженій контингенті свиней різного віку господарстві, неблагополучному по актинобациллёзной плевропневмонии свиней. Після цього у тому ж господарстві проводилася поголовна вакцинація тварин за такою схемою: внутримышечно свиноматкам за 20−25 днів до очікуваного опоросу в дозі 1 [pic], аналогічну дозу вводили ремонтним свинкам, поросят вакцинировали в дозі 1[pic] в віці 35 — 40 дні і. У період проведених досліджень вакцинації було піддане 1677,4 тисячі свиней.

Дослідження засвідчили, що на початок вакцинації падёж свиней з діагнозом актинобациллёзной плевропневмонии становив 30,22% від загального кількості полеглих тварин, при часткової вакцинації поголів'я -12,28%, при повної вакцинації - 8,89%. Між рівнем вакцинації і падёжом свиней від актинобациллёзной плевропневмонии встановлено досить сильна зворотна зв’язок (r= -0,71). Застосування вакцини забезпечило зниження відходу свиней по причини актинобациллёзной плевропневмонии, залежно від аналізованого періоду в 3 — 5 разів, і збільшення живої маси поросят на 7,42 — 8,29 кг при передачі на відгодівлю. Частота терапевтичного втручання ветеринарного персоналу в групах вакцинованих поросят був у 2,11 разу рідше, ніж серед не вакцинованих животных.

Висновки Дослідження таксономического становища эпизоотических штамів НАД— залежних бактерій, виділених при пневмоніях і генералізованих серозитах свиней методом нумерического аналізу, дозволило диференціювати їх за фенотипическим властивостями на кластери, відповідні видам Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis і таксону гемофильных бактерій «мала група». Культури кластера Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae мають більше фенотипическое схожість із видами роду Actinobacillus (91,23) і менше з представниками роду Haemophilus (81,99%). На рівні подоби 95% бактерій кластера «мала група» виділяються в самостійний таксон. Генетичний аналіз таксономического становища референтних і эпизоотических НАД—зависимых штамів Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae і культур P. haemolytica — подібних бактерій (2-ой биовар A. pleuropneumoniae) показав, що вони утворюють генетичну спільність з рівнем гомології ДНК 70- 98%. ДНК культур 2-го биовара і эпизоотических штамів A. pleuropneumoniae мають гомологию з ДНК A. suis — 33 — 38%, з ДНК H. parasuis і P. multocida — трохи більше 9%, що свідчить про приналежності эпизоотических і референтних штамів до роду Actinobacillus, але з Haemophilus і Pasteurella. Референтний штам J 95 гемофильных бактерій таксони «З» за результатами гібридизації ДНК до роду Haemophilus не належить. Результати вивчення таксономического становища НАД—зависимых бактерій, виділених при пневмоніях і серозитах свиней, дозволили накинути у ролі основних дифференцирующих фенотипических ознак: НАД—зависимость, освіту лужної фосфатозы, уреазы, гемолизина, кислоти з ксилози, маннита, маннозы. Для диференціації культур НАД—независимого биовара A. pleuropneumoniae від подібних бактерій мінімальний набір визначених ознак включає продукцію індолу, уреазы, утилізацію цитратов, наявність жгутиков. Для встановлення ферментативних властивостей НАД— залежних бактерій можна використовувати дифференциально — діагностичні середовища в микрообъёмах і діагностичний набір ПБДЭ Горьковського НИЭМ, що виключає використання чистого НАД чи інших джерел як чинників зростання. До A. pleuropneumoniae і H. parasuis чутливі при внутрибрюшинном і интраназальном зараження морські свинки (жива маса 200−250г) і білі миші (жива маса 14−16г), які можна використовуватимуться визначення патогенних властивостей культур, вивчення питань пато — і імуногенезу при цих інфекції. Вхідними воротами збудника інфекції при гемофилёзном полисерозите є органи дихання. При експериментальному (трахеальном) зараження свиней H. parasuis інкубаційний період становить 6−8 годин. У заражённых свиней розвивається катаральна пневмонія і цього диссеминации збудника, генерализованные серозиты з одночасним поразкою серозних оболонок грудної, черевної порожнин, пери — і эпикарда. У природничих умовах H. parasuis викликає в поросят-отъёмышей пневмонію, частина тварин розвивається септическая стадія із поразкою серозних оболонок, суглобів, мозку. В окремих поросят зустрічається класична форма хвороби Глессера — генерализованные серозиты без мікроскопічно вираженої пневмонії. У експериментально заражённых і природно хворих свиней найчастіше вдається ізолювати H. parasuis з уражених серозних оболонок. Вхідними воротами збудника інфекції при актинобациллёзной плевропневмонии свиней є органи дихання. Інкубаційний період при експериментальному интраназальном зараження становить 2−4 години, контактному — до 3 діб, мови у природничих умовах — 2−8 діб. Диссеминация збудника в організмі заражённых тварин відбувається і натомість наявних змін — у легких. Найбільш постійно культури збудника вдається ізолювати від експериментально заражённых і, природно хворих тварин із поражённой тканини легких і регионарных лімфатичних вузлів. Культури A. pleuropneumoniae у початковій стадії логарифмічного зростання синтезують термолабильные гемолизин і экзотоксин, які визначають підвищену вірулентність молодих (6−8- вартових) культур збудника і грають істотну роль розвитку патологічних змін — у легких заражённых тварин. Макроскопически подібних змін в легких свиней можуть викликати A. pleuropneumoniae, гемофильные бактерії «малої групи» і A. suis, тому вирішальне значення у діагностиці актинобациллёзной плевропневмонии мають результати бактеріологічної дослідження. При серологической ідентифікації эпизоотических культур H. parasuis встановлено наявність сероваров А, В, С, Д, Бакоса, і навіть виявлено чотири серологические групи штамів, не вкладаються в відому схему Бакоса, яка охоплює всього антигенного різноманіття виду. Серологічна ідентифікація эпизоотических культур A. pleuropneumoniae, виділених від свиней у господарствах Російської Федерації, виявила наявність сероваров 2,3,4,6 і групи нетипируемых штамів. Дослідження в РНГА сироваток крові свиней із різних господарств показало домінування антитіл до сероварам 1,2,4,6,12. З проведених досліджень розроблено й використовують у практиці схема лабораторної діагностики актинобациллёзная (гемофилёзная) плевропневмонии і гемофилёзного полисерозита свиней, куди входять: правила взяття матеріалу для бактеріологічної дослідження, методи виділення, тож ідентифікації культур збудника по біологічним властивостями. Також розробити й подати рекомендовані методи видовий і серовариантной ідентифікації культур A. pleuropneumoniae і виявлення антигенів цього виду бактерій в патологічному матеріалі з допомогою реакції коагглютинации. Розроблена та запропонована технологію виготовлення, контролю використання вакцини проти гемофилёзной (актинобациллёзная) плевропневмонии свиней, що відбилося у нормативні документи: «Інструкція із виготовлення та контролю вакцини проти гемофилёзной плевропневмонии свиней», «Вакцина проти гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированная. Технічні умови ТУ 10−09−53−90». «Наставляння по застосуванню вакцини проти гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированной», затверджених ГУВ ДК Радміну СРСР з продовольства і закупівлям 11.07.1990 г. Инактивированные вакцини з клітин A. pleuropneumoniae мають значної залишкової токсичністю. Ефективне зниження токсичності готових препаратів досягається інактивацією бактеріальних суспензий 0,2% формальдегіду з наступним выдерживанием до вживання при 4−6(С в протягом 45 діб. Як лабораторних моделей в оцінці імуногенності инактивированных актинобациллёзных вакцин можна використовувати білі миші - підшкірна дворазова імунізація з наступним внутрибрюшинном зараженням різними дозами вирулентной культури, чи морські свинки у варіанті підшкірній вакцинації з наступним интраназальном зараженням. Максимальної иммуногенностью для свиней мають инактивированные эмульгированные вакцини з клітин A. pleuropneumoniae з включенням у їх склад розчинних антигенів, що накопичуються у реакторних культурах в процесі зростання. Досліди прямого зараження під час випробування ефективності імунізації в умовах неблагополучного господарства встановлено, що розроблена інактивована вакцина не захищає повністю иммунизированных свиней від зараження, але забезпечує більш легке перебіг хвороби, зокрема знижується відхід в 3−5 раз, частота терапевтичного втручання знижується в 2,11 разу, збільшується жива маса поросят під час передачі на відгодівлю на 7,42 — 8,29 кг, що дозволяє розглядати вакцинацію як економічно доцільний складовою компонент комплексу лікувально-профілактичних заходів боротьби з актинобациллёзной плевропневмонией свиней.

Практичні пропозиції. Тимчасові методичні вказівки по лабораторної діагностики гемофилёзного полисерозита поросят. Рекомендовані МСХ СРСР 17.01.1978 г. № 116−18. Тимчасові методичні вказівки по лабораторної діагностики гемофилёзной плевропневмонии свиней. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 16.04.1981 г. Методичні вказівки з діагностики гемофилёзов свиней. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 2.11.1985г. № 115−6а. Методичні свідчення про виготовлення й застосування їх коагглютинирующего антительного диагностикума для експрес — ідентифікації Гемофилюс плевропневмоние і індикації збудника в патологічному матеріалі. Затверджено відділенням ветеринарії РАСХН 16.02.1993 г. Тимчасова інструкція про заходи боротьби з гемофилёзами свиней. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 2.11.1985г. № 115—6а. Інструкція з виготовлення та контролю вакцини проти гемофилёзной плевропневмонии свиней. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 11.07.1990 г. Вакцина проти гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированная. Технічні умови ТУ 10−09−53−90. Затверджено ГУВ МСХ СРСР 11.07.1990 г. Наставляння щодо застосування вакцини проти гемофилёзной плевропневмонии свиней. Затверджене ГУВ МСХ СРСР 11.07.1990 г.

Список опублікованих робіт. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Тарасенок Н.І. та інших. — Інфекційний полисерозит поросят // Свинарство, 1976 № 11,35−36. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Гумбатов Ю. К. — Патогенність збудника гемофилёзного полисерозита для лабораторних тварин і звинувачують поросят // Праці ВИЭВ, 1977, Т.45,50−54. Скородумов Д.І., Гумбатов Ю. К. — Виділення збудника гемофилёзного полисерозита вивчення для її властивостей // Бюл. ВИЭВ, 1977, вып.21,14- 17. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Гумбатов Ю. К. — Роль бактерій роду Гемофилюс в інфекційної патології тварин // Ветеринарія, 1978, № 5,102−108. Тимчасові методичні вказівки по лабораторної діагностики гемофилёзного полисерозита свиней (ГУВ МСХ СРСР. 17.10.1978) / Сидоров М. А., Скородумов Д.І. Шубін В.А., Сидоров М. А., Андрыишин…, Скородумов Д.І. — Патоморфологічні зміни в хворих полисерозитом поросят // Праці ВИЭВ, 1978, т.47,135−141. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Шубін В.А., Тарасенок Н.І., Гумбатов Ю. М. — Експериментальний гемофилёзный полисерозит поросят // Праці ВИЭВ, 1979, т.49,90−95. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Тарасенок Н.І., Гумбатов Ю. К. — Імуногенність вакцини проти гемофилёзного полисерозита поросят // Доповіді ВАСГНІЛ, 1980, № 8,30. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Гумбатов Ю. К., Тарасенок Н.І. — Серологические варіанти гемофильных бактерій виділених від свиней // Ветеринарія, 1980, № 4,66−67. Скородумов Д.І., Сидоров М. А. — Характеристика гемолитических гемофильных бактерій виділених від хворих пневмонією свиней // Праці ВИЭВ, 1980, т.52., 13−18. Шубін В.А., Сидоров М. А., Скородумов Д.І. — Динаміка змін — у легких поросят у ході експериментального інфекційному полисерозите // Збірник «Патоморфология, патогенез і діагностика хвороб сх тварин». Наукові праці ВАСГНІЛ, Москва, 1980, 128−131. Сидоров М. А. Скородумов Д.І. — Властивості Гемофилюс плевропневмоние виділених від хворих свиней // Ветеринарія, 1981, № 1,45−47. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Лаврентьєв Н.І., Мицаев Ш. Ш., Романова Л., Юдін А.І. — Діагностика гемофилёзной плевропневмонии свиней // Ветеринарія, 1981, № 12, 66−68. Тимчасові методичні вказівки по лабораторної діагностики гемофилёзной плевропневмонии свиней (ГУВ МСХ СССР.1981 / Сидоров М. А., Скородумов Д.І.). Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Панов В. С., Гушин В. М., Сєдов В.А. — Вакцина проти гемофилёзной плевропневмонии свиней, спосіб її виготовлення і загальнодосяжний спосіб профілактики гемофилёзной плевропневмонии свиней. Прим. авт. свідчення на винахід № 907 899 від 21.10.81 г. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Тарасенок Н.І., Шубін В.А. — Спосіб приготування вакцини проти гемофилёзного полисерозита поросят. Прим. авт. свідчення на винахід № 957 472 від 07.05.1982 г. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Гущин В. А. — Не дозволяйте захворювання свиней гемофилёзами // Газета — плакат МСХ СРСР, Москва, Колос, 1982, № 7. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Лаврентьєв Н.І. — Специфічна профілактика гемофилёзной плевропневмонии свиней // Збірник «Ветеринарні проблеми, у промислове свинарство», Київ, 1983, 97−98. Лаврентьєв Н.І., Скородумов Д.І., Романова Л., Финенко Р. Ф. — Застосування РА у діагностиці гемофилёзной плевропневмонии свиней // Збірник наукових праць «Інфекційні хвороби сх тварин», Омськ, 1983. Скородумов Д.І., Гумбатов Ю. К., — Потреба бактерій роду Гемофилюс в ростових чинниках. // Бюлетень ВИЭВ, 1983, вып.45, 6−9. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Лаврентьєв Н.І. — Гемофилёзная плевропневмонии свиней // Свинарство, 1984, № 4,14−15. Тимчасова інструкція про заходи боротьби із захворюваннями свиней гемофилёзами (ГУВ МСХ СРСР 2.11.1985) / Сидоров М. А. Методичні вказівки з діагностики гемофилёзов свиней (ГУВ МСХ СРСР 2.11.1985) / Сидоров М. А., Скородумов Д.І. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Логінов І.А., Лаврентьєв Н.І. — Профілактика гемофилёзной плевропневмонии свиней // Ветеринарія, 1985, № 12,37−38. Шубін В.А., Татришвили І.П., Сидоров М. А., Скородумов Д.І. — Патоморфологічні зміни при гемофилёзной плевропневмонии поросят // Ветеринарія, 1985, № 11, 40−43. Сидоров М. А., Скородумов Д.І. — Гемофилёзы тварин. Агропромиздат.М.1986.

Сидоров М.А., Мицаев Ш. Ш., Скородумов Д.І. — Патогенність H. pleuropneumoniae тваринам // Ветеринарія, 1989, № 11, 39−41. Вакцина проти гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированная. Технічні умови ТУ 10−9 059−90 (ГУВ МСХ СРСР 11.07.1990) / Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Логінов І.А., Суботін В.В., Мохина Т.ЗВ. Інструкція із виготовлення та контролю вакцини проти гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированной (ГУВ МСХ СРСР 11.07.1990) / Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Логінов І.А., Суботін В. В. Наставляння щодо застосування вакцини проти гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированной (ГУВ МСХ СРСР, 11.07.1990) / Сидоров М. А. Скородумов Д.І., Логінов І.А. Суботін В. В. Сидоров М.А., Скородумов Д.І., Столяренка В. Т., Суботін В, В. — Специфічна профілактика гемофилёзного полисерозита поросят // ВАСГНІЛ, НТЦ. Науково-технічної інформаційний збірник. Москва, 1991, вып.9. Сидоров М. А., Лаврентьєв Н.І., Суботін В.В., Логінов І.А., Скородумов Д.І. — Ефективність вакцинації проти гемофилёзной плевропневмонии свиней // Ветеринарія, 1991, № 4,25−27. Скородумов Д.І., Бурлак В. А., Костенко Т. С. — Таксономія бактерій сімейства Pasteurellaceae // Методичні вказівки. Москва, 1991. Скородумов Д.І., Сидоров М. А., Пруссак-Глотов В.Е. — Збудники фибринозно-геморрагической плевропневмонии свиней // Ветеринарія, 1992, № 6,21−24. Фомін Б.А., Коромыслов Г. Ф., Артюшин С. К., Скородумов Д.І., Сидоров М. А. — Гомология ДНК H. pleuropneumoniae та деяких менших видів бактерій сімейства Pasteurellaceae // Ветеринарія, 1992, № 6,28−30. Скородумов Д.І., Сидоров М. А., Блему Ж. — Методичні свідчення про виготовлення й застосування їх коагглютинирующего диагностикума для експрес — ідентифікації Гемофилюс плевропневмонии і індикації збудника в патологічному матеріалі // Відділення ветеринарії РАСХН. 13.02.1993. Скородумов Д.І. — Властивості гемолизинов збудника актинобациллёзной плевропневмонии свиней // Збірник наукової праці «Актуальні питання інфекційних і інвазійних хвороб тварин». Москва, 1995, 50−52. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Федотов В. Б. — Визначник зоопатогенных бактерій (довідкова книга) М., Колос, 1995. Сидоров М. А., Скородумов Д.І., Блему Ж. — Застосування реакції коагглютинации для ідентифікації збудника актинобациллёзной плевропневмонии свиней // Матеріали Всеросійської науковій конференції «Інфекційні хвороби молодняку сх тварин». М., 1996, 47−49. Скородумов Д.І., — Критерії диференціації гемофильных бактерій патогенних для свиней // Збірник наукової праці «Актуальні питання інфекційних і інвазійних хвороб тварин», Москва, 1996, 106−109. Скородумов Д.І. — Патогенні властивості культур збудника гемофилёзной плевропневмонии свиней // Збірник наукової праці «Актуальні питання інфекційних і інвазійних хвороб тварин», Москва, 1996, 104−106.