История і методологія клонування

История і методологія клонирования

Эта тема чудово відбито у статті Конюхова Бориса Володимировича — доктора біології, завідувача лабораторії генетики розвитку Інституту загальної генетики імені Н.І. Вавилова. Я просто наведу її текст :

Долли — випадок чи закономерность?

Термин «клон «походить від слова «klon », що означає - гілочка, втеча, живець, і причетний насамперед до вегетативному розмноженню. Клонування рослин черешками, нирками чи бульбами у сільському господарстві, зокрема у садівництві, відомо більш 4-х тис. років. Починаючи з 1970;х років нашого століття для клонування рослин стали широко використовувати невеликі групи і поодинокі соматичні (неполовые) клетки.

Дело у цьому, що з рослин (на відміну тварин) в міру їхнього зростання ході клітинної спеціалізації - диференціювання — клітини не втрачають про тотипотентних властивостей, тобто. не втрачають своєї здатності реалізовувати всю генетичну інформацію, закладену в ядрі. Тому будь-яка рослинна клітина, котра зберегла у процесі диференціювання своє ядро, може дати початок новому організму. Ця особливість рослинних клітин є основою багатьох методів генетики і селекции.

При вегетативному розмноженні і за клонуванні гени не розподіляються по нащадкам, як у статевого розмноження, а зберігаються у складі протягом багатьох поколінь. Усі організми, що входять до склад певного клона, мають однаковий набір генів і фенотипічно не різняться між собой.

Клетки тварин, диференціюючи, позбавляються тотипотентности, й у — одна з істотних їх відмінностей від клітин рослин. Як показано нижче, саме тут — головна перешкода для клонування дорослих хребетних животных.

Первые досліди на амфибиях

Возможность клонування ембріонів хребетних уперше було показано початку 1950;х років в дослідах на амфибиях. Американські дослідники Бриггс і Кінг розробили микрохирургический метод пересадки ядер ембріональних клітин із допомогою тонкої скляній піпетки в позбавлені ядра (энуклеированные) яйцеклітини [1]. Вони встановили, що й брати ядра з клітин зародка у ранній стадії його розвитку — бластуле, то приблизно 80% випадків зародок благополучно розвивається далі і перетворюється на нормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра, просунулося для наступної стадію — гаструлу, лише менш як за 20% випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. Ці результати пізніше підтверджено та інших работах.

Большой внесок у цю галузь вніс англійський біолог Гердон. Він у дослідах з південноафриканськими жабами Xenopus laevis (1962) як донора ядер використовував не зародкові клітини, а потім уже цілком спеціалізувалися клітини епітелію кишечника плаваючого пуголовка [2]. Ядра яйцеклітин реципієнтів не видаляв хірургічним шляхом, а руйнував ультрафіолетовими променями. Найчастіше реконструйовані яйцеклітини не розвивалися, але приблизно десята частина їхньої них утворювала ембріони. 6,5% з цих ембріонів досягали стадії бластулы, 2,5% - стадії пуголовка і лише 1% розвився в статевозрілих особин (рис. 1). Проте поява кількох дорослих особин таких умов може бути пов’язана з тим, що з клітин епітелію кишечника що розвивається пуголовка досить тривалий час присутні первинні статеві клітини, ядра яких були використовуватимуться пересадки. У наступних роботах як сам автор, і багато інші дослідники ми змогли підтвердити дані цих перших опытов.

Позже Гердон модифікував експеримент [3]. Оскільки більшість реконструйованих яйцеклітин (з ядром клітини кишкового епітелію) гинуть до завершення стадії гаструлы, він спробував отримати від них ядра на стадії бластулы і знову пересадити в нові энуклеированные яйцеклітини (таку процедуру називається «серійної пересадкою «на відміну «первинної пересадки »). Кількість зародків з розвитком після цього збільшувалася, і вони розвивалися до пізніх стадій проти зародками, одержаними у результаті первинної пересадки ядер.

Затем Гердон разом із Пестощів (1970) стали культивувати in vitro (поза організмом в живильному середовищі) клітини нирки, легені й шкіри дорослих тварин і звинувачують використовувати вже ці клітини як донорів ядер [4]. Приблизно 25% первинне реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластулы. При серійних пересадки вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка. Отже було показано, що різні клітини трьох різних тканин дорослого хребетного (X. laevis) містять ядра, що потенційно можуть забезпечити розвиток за крайнього заходу до стадії головастика.

В сною чергу ДиБерардино і Хофнер використовували для трансплантації ядра недслящихся і полносгью диференційованих клітин крові - еритроцитів жаби Rana pipiens [5]. Після серійної пересадки таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка. Проте навіть з допомогою багатократних серійних пересадок (понад сто клітинних циклів) реконструйовані яйцеклітини далі стадії пуголовка не развивались.

Таким чином, у багатьох роботах показано, у разі амфібій донорами ядер можуть бути лише зародки на ранніх стадіях розвитку. Деякі автори називають подібні експерименти клонуванням амфібій, хоча правильніше називати їхні клонуванням ембріонів амфібій, позаяк у такому випадку ми розмножуємо безстатевим шляхом не дорослих тварин, а зародышей.

Дифференцировка клітин на ході розвитку хребетних супроводжується інактивацією непрацюючих генів. Тому клітини втрачають тотипотентність, диференціювання стає необоротною. Зрештою тільки в клітин відбувається повне репрессирование геному, в інших — у тому чи іншою мірою деградує ДНК, а деяких випадках руйнується навіть ядро. Проте із диференційованими кочетками культивовані in vitro клітинні популяції містять малодифференцированные власні стовбурні клітини, що й можна використовувати як донори ядер для клонування млекопитающих.

Опыты з амфібіями показали, що ядра різних типів клітин однієї й тієї ж організму генетично ідентичні і під час клітинної диференціювання поступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованих яйцеклітин, проте серійні пересадки ядер і культивування клітин in vitro в якійсь мірі збільшує цю способность.

Неудачи експериментів із мышами

Успешные досліди з амфібіями змусили учених обдумати клонуванні ембріонів ссавців, зокрема мишей. МакКиннел на одній із своїх робіт зазначав, що всі необхідні при цьому методи вже є, незрозуміло, чому миша до цього часу не клонирована. На його думку, першими об'єктами мають стати саме дрібні тварини, такі як миша чи кролик. Проте пророцтво МакКиннелла не збулося, хоча наприкінці 1970;х років досліди на мишах справді розпочалися і протікали дуже драматично. На той час, зауважу, дуже грунтовно прокуратура вивчила біологія і генетика ранніх етапів розвитку ссавців, і зокрема, миші як модельного объекта.

Работа методично виявилася досить важкою, насамперед тому, що міра яйцеклітини у ссавців приблизно тисячу разів менше, ніж в амфібій. Але ці труднощі були успішно подолані. Експериментатори навчилися микрохирургически видаляти пронуклеусы [6] з зигот (запліднених яйцеклітин) миші і пересаджувати у яких клітинні ядра ранніх ембріонів. Але всі отримані у різний спосіб зародки мишей розвивалися лише до стадії бластоцисты [7].

6. Пронуклеус — з двох гаплоидных ядер в яйці ссавців під час після проникнення сперматозоїда, але до злиття чоловічого й основою жіночого пронуклеусов в ядро зиготи у процесі запліднення. Чоловіче ядро формується з ядерного матеріалу сперматозоїда, жіноче — з хромосом яйцеклетки.

7. Бластоциста (бластула) — зародок ссавців одній із ранніх стадій розвитку, ще до його його імплантації в матку.

В 1977 року з’явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Илменси у тому, що вони отримали сім дорослих самок мишей, п’ять із яких мали голько магеринский, а дві - батьків геном [8]. Це, нібито, чого залежало від гого, який пронуклеус був залишено в яйці - жіночий чи чоловічої, і визначав розвиток особини але типу гиногенеза чи андрогенеза. Їх успіх була пов’язана, але опису авторів, з гем, що, видаляючи один нронуклеус, вони подвоювали число хромосом іншого, обробляючи яйця спеціальним речовиною, потім вирощували отримані диплоидные гомочиготные (з цими двома однаковими наборами генів) зародки in vitro до стадії бластоцисты і пересаджували в матку самки-реципиента задля її подальшого развития.

Казалось, тепер можна буде скоро отримувати ссавців зі 100-відсотковій гомозиготностью по всім генам. Особливо важливо в селекції, оскільки щоб одержати сільськогосподарських тварин, зокрема, великої рогатої худоби, з закріпленими особливо цінними якостями звичайними прийомами потрібні десятки років работы.

Однако, на жаль, дані Хоппе і Илменси підтвердити зірвалася, хоча багато хто намагалися це. Виявилося, що отримане у будь-який спосіб диплоидные андрогенетические і гиногенетические зародки мишей гинуть тих-таки стадіях, як і диплоидные партеногенетические (що розвиваються з незаплідненою яйцеклітини) эмбрионы.

Значительно вдосконаливши методи вилучення ядер і введення в клітину, МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, що високий вихід живих мишей вони мали, коли як донорів ядер використовували зиготи, якщо донорами були ранні ембріони, то реконструйовані яйцеклітини, як й раніше, розвивалися лише до стадії бластоцисты [9].

Метод МакГрата і Солтера став широко використовуватися різними експериментаторами. Так, Манн і Ловел-Бадж виділяли пронуклеусы з яєць, активованих до партеногенезу, і пересаджували їх энуклеированные зиготи мишей [10]. У таких випадках ембріони гинули на ранніх стадіях. Якщо ж, навпаки, пронуклеусы одержували доходи з запліднених яєць і пересаджували в партеногенетически активовані і позбавлені ядра яйця, то такі зародки розвивалися нормально до народження. Сурани з співавторами встановили, що й додати жіночий пронуклеус з зиготи миші до гаплоидному набору хромосом яйцеклітини, то розвитку немає, додавання ж чоловічого ядра призводить до нормального розвитку [11]. З іншого боку, рекомбінації чоловічого й основою жіночого пронуклеусов із різних запліднених яйцеклітин мишей забезпечує нормальний розвиток, а комбінація двох чоловічих чи двох жіночих пронуклеусов зупиняє розвиток ембріона [12].

Эти досліди показали, що з розвитку ссавців потрібні два набору хромосом — батьків і материнський. Тому в однієї з видів відомих ссавців не описаний партеногенез. Тому роботи Хоппе і Илменси зірвалася повторить.

Однако ці дослідники ще двічі збурювали наукова спільнота. У 1982 року вони пересадили ядра клітин партеногенетических бластоцист мишей в энуклеированные зиготи Деякі з цих реконструйованих яйцеклітин нормально розвивалися, і нібито отримано чотири дорослих самки. У цьому світлі вищесказаного ці результати дуже маловероятны.

Гибель партеногенетических (гиногенетических) і андрогенетических зародків у ссавців пов’язані з різної активністю в онтогенезі материнського і батьківського геномів. Механізм, регулюючий ці функціональні відмінності, був названо геномным импринтингом [13] і вивчався у низці робіт, де засвідчили, що з розвитку ссавців потрібно наявність чоловічого геному. Інша стаття Илменси і Хоппе [14] мала ще більшу резонанс.

Авторы повідомили про пересадці ядер клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисты в энуклеированные зиготи мишей й одержанні трьох дорослих мишей (двох самок і самця), генетично ідентичних донорської лінії мишей. Запровадження ядер-доноров і видалення пронуклеусов з зиготи проводили за прийом, потім реконструйовані яйцеклітини культивували in vitro до стадії бластоцисты і пересаджували в матку самок. З 16-ти пересаджених бластоцист три розвинулися у дорослих тварин. У наступній роботі (1982) ці самі автори використовували у ролі донорів ядер клітини ембріонів ще більше пізніх стадій (7 діб) і нібито отримали трьох статевозрілих мишей. Однак з що працюють у тому самому напрямі не зумів домогтися таких результатів, і достовірність даних Илменси і Хоппе була знову поставлена під сомнение.

МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клеточных зародків і клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисты не забезпечують розвиток in vitro реконструйованих яйцеклітин до стадії морулы, яка передує стадії бластоцисты [15]. Невелика частина (5%) ядер 4-клеточных зародків дає можливість розвиватися лише до стадії морулы. У той самий час 19% реконструйованих яйцеклітин, містять ядра 2-клеточных зародків, змогли досягти стадії морулы чи бластоцисты.

Эти і ще дані показують, що у эмбриогенезе у мишей клітинні ядра рано втрачають тотипотентність, що пов’язано очевидно, з дуже ранньої активацією геному зародка — на стадії 2-х клітин. В інших ссавців, в частковості, у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активація першої групи генів у эмбриогенезе відбувається пізніше, на 8−16-клеточной стадії. Можливо тому перші неабиякі успіхи в клонуванні ембріонів досягнуто на інші види ссавців, а чи не на мишах. Проте, роботи з мишами, попри її непросту долю, значно розширили наші ставлення до методології клонування млекопитающих.

Кролики, корови і свиньи

Американские исследонатели Стик і Робл, використовуючи методику МакГрата і Солтера, отримали 6 живих кроликів, пересадивши ядра 8клеточных ембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів інший породи [16]. Фенотип народжених цілком відповідав фенотипу донора.

Однако лише 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися в нормальних тварин. Це, звісно, принизливий вихід, мало дозволяє одержання в такий спосіб клона генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи тим щонайменше у цьому. що вона мала можливість клонування ембріонів кроликов.

Работа з реконструйованими яйцеклітинами великих свійських тварин, корів чи овець, йде трохи інакше. Їх спочатку культивують не in vitro, a in vivo — в перев’язаному яйцеводе вівці - проміжного (першого) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (другого) реципієнта — корови чи вівці відповідно, де з їхніми розвиток відбувається до народження дитинча. Уиладсин запропонував укладати реконструйовані яйцеклітини в агаровый циліндр, що він потім трансплантировал в перев’язаний яйцевод вівці [17]. По даним одних авторів реконструйовані зародки краще розвиваються в яйцеклітині, ніж у культуральної середовищі, хоча деякі дослідники отримали непоганих результатів і за культивировании.

Американцы Робл і його працівники, використовуючи щадний метод вилучення ядра без проколювання мембрани яйцеклітини, запропонований МакГратом і Солтером, пересаджували в зиготи звані кариопласты — чоловічої підтримки й жіночий пронуклеусы разом із оточуючої їх цитоплазмой, і навіть ядра 2-, 4- чи 8-клеточных эбрионов корови [18]. Спочатку зиготи центрифугировали щоб звільнити пронуклеусы від що оточують їх гранул жовтка, після чого ядра були видно під мікроскопом (рис. 2а), що значно полегшувало їх видалення (рис. 2б). З допомогою маніпулятора і загостреної скляній микропипетки вилучали одне із бластомеров разом із ядром з ранніх зародків (рис. 2в) і переносили їх у энуклеированную зиготу (рис. 2г).

Реконструированные зародки було укладено в агаровый циліндр і пересаджені в перев’язаний яйцевод вівці. Через п’ять днів культивування їх вимивали, звільняли від агару і досліджували. Реконструктурированные зародки у цій роботі розвивалися лише у тому випадку, як у зиготи пересаджували пронуклеусы: 17% таких зародків досягли стадії морулы чи бластоцисты. Два зародка були пересаджені другому реципієнту — в матку корови, та розвитку їх завершилося народженням живих телят. Якщо як донорів використовували ядра 2-, 4- чи 8-клеточных зародків, то реконструйовані яйцеклітини не розвивалися до стадії морулы.

Позже були й успішніші роботи. Уиладсин, зокрема. повідомив, що йому вдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейнской породи внаслідок пересадки в реципиентные яйцеклітини ядер бластомеров одного 32-клеточного зародка [19] (рис. 3). Автор стверджував, більшість ядер зберігає тотипотентність на 32-клеточной стадії, а значна частина їх навіть у 64-клеточной стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії ранньої бластоцисты в яйцеводе вівці. Після пересадки в матку корів — остаточних реципієнтів, як автор, вони можуть і далі нормально развиваться.

Бондиоли і співавтори, використовуючи як донорів ядер 16−64-клеточные зародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в матку синхронізованих реципієнтів, і це отримано 92 живих теляти [20]. Семеро з них генетично ідентичні, бувши клон, отриманих у результаті пересадки ядер клітин одного донорського эмбриона.

Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби який досить довго зберігають тотипотентність і може забезпечити повне розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше висловлюючись, методичні труднощі клонування зародків великої рогатої худоби практично вирішені. Але залишається основне завдання — знайти донорські ядра, які мають тотипотентностью, для клонування дорослих животных.

Клонированию ембріонів свиней присвячена лише одне невеличка робота [21]. Убогість даних, видимо. и пов’язана із певними труднощами роботи з цим объектом.

Клонирование овец

Уиладсин ще 1986 року показав, як і в ембріонів овець на 16-клеточной стадії розвитку ядра зберігають тотипотентність [22]. Реконструйовані яйцеклітини, містять ядра бластомеров 16-клеточных зародків, розвивалися нормально до стадії бластоцисты в перев’язаному яйцеводе вівці (в агаровом циліндрі), а після звільнення з агару і пересадки в матку вівці - другого реципієнта — ще 60 днів. Іншим разом донорами служили ядра 8-клеточных зародків і було отримані 3 живих ягняти, фенотип яких соотнетстиовал породі овець — доноров.

В 1989 року Сміт і Уилмут трансплантували ядра клітин 16-клеточного ембріона і ранньої бластоцисты в позбавлені ядра незапліднені яйцеклітини овець [23]. У першому випадку отримали дві живі ягняти, фенотип яких відповідав породі овець — донорів ядер. У другий випадок один повністю що сформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип також відповідав породі - донору. Автори вважали, що під час диференціювання ембріональних клітин відбувається інактивація деякі важливі у розвиток генів, у яких ядра бластоцисты не можуть репрограммироваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечить нормальну розвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, як донорів ядер краще використовувати 16-клеточные ембріони чи культивовані in vitro лінії ембріональних клітин, ядра яких мають тотипотентностью.

Позднее, в 1993;1995 роках, група дослідників під керівництвом Уилмута отримала клон овець — 5 ідентичних тварин, донорами ядер яких було культура ембріональних клітин [24]. Клітинну культуру отримували так: виділяли микрохирургически ембріональний диск з 9-дневного овечого ембріона (бластоцисты) і культивували клітини in vitro багато пасажів (по крайнього заходу до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стовбурових недиференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2−3-х пасажів, клітини ставали уплотненными і морфологічно подібними з эпителиальными. Ця лінія клітин з 9-дневного зародка вівці була як TNT4.

Чтобы донорське ядро і реципиентная цитоплазма перебували на подібних стадіях клітинного циклу, зупиняли розподіл культивованих клітин TNT4 на певної стадії (GO) і ядра цих клітин пересаджували в энуклеированные яйцеклітини (відповідно на стадії метафазы II). Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували в перев’язані яйцеводы овець. Через 6 днів ембріони вимивали з яйцевода першого реципієнта і науково досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, котрі досягли стадії морулы чи бластоцисты і пересаджували в матку вівці - остаточного реципієнта, де розвиток тривало до народження. Народилося 5 ягнят (самок) їх 2 загинули невдовзі після народження, 3-й у віці 10 днів, а 2 решти нормально розвивалися і маємо 8−9-місячної віку. Фенотипічно все ягнята були єдині з породою овець, від якої отримували вихідну лінію клітин TNT4. Це підтвердив і генетичний анализ.

Эта робота, особливо у частині культури ембріональних клітин, — значне досягнення в клонуванні ссавців, хоча вона викликала такої гамірного інтересу, як стаття тієї самої Уилмута з співавторами, опублікований у початку 1997 року, яка повідомляла, у результаті використання донорського ядра клітини молочної залози вівці отримали клональное тварина — вівця на прізвисько Доллі [25]. Остання робота методично багато в чому повторює попереднє дослідження 1996 року, проте у ній вчені використовували як ембріональні, але що й фибробластоподобные клітини (фибробласты — клітини сполучної тканини) плоду і клітини молочної залози дорослої вівці. Клітини молочної залози одержували від шестирічної вівці породи фін дорcет, яка перебуває на останньому триместрі вагітності. Усі три типу клітинних культур мали однакове число хромосом — 54, звісно ж у овець. Ембріональні клітини використовували як донорів ядер на 7−9-м пасажах культивування, фибробластоподобные клітини плоду — на 4−6-м пасажах і клітини молочної залози — на 3−6-м пасажах. Розподіл клітин всіх трьох типів зупиняли на стадії GO і ядра клітин пересаджували в энуклеированные ооциты (яйцеклітини) на стадії метафазы II. Більшість реконструйованих ембріонів спочатку культивували в перев’язаному яйцеводе вівці, та деякі і in vitro в хімічно певної середовищі. Коефіцієнт виходу морул чи бластоцист при культивуванні in vitro у серії дослідів було навіть удвічі більше, аніж за культивуванні в яйцеводе. (Тому, певне, немає рядки потреби у проміжному реципиенте і можна обійтися культивуванням in vitro. Проте задля цілковитої певності щодо цьому потрібні додаткові данные.).

Выход морул чи бластоцист у серії дослідів з культурою клітин молочної залози був в три рази менше, ніж у інших серіях, коли як донорів ядер використовували культуру фібробластів плоду чи ембріональних клітин. Кількість живих ягнят тоді як числом пересаджених в матку остаточного реципієнта морул чи бластоцист було й у вдвічі нижчий. У серії дослідів з клітинами молочної залози з 277 реконструйованих яйцеклітин було отримано лише одне живої ягня, що свідчить про дуже низької результативності що така експериментів (0,36%). Аналіз генетичних маркерів всіх семи що народилися трьох серіях експериментів живих дитинчат показав, що різні клітини молочної залози були донорами ядер на одне, фибробласты плоду — обох і ембріональні клітини — чотирьох ягнят. Вівця на прізвисько Доллі розвинулася з реконструйованої яйцеклітини, донором ядра якої був культивована клітина молочної залози вівці породи фін дорсет і фенотипічно не відрізняється від овець цієї породи, але дуже відрізняється від овцы-реципиента. Аналіз генетичних маркерів підтвердив цей результат.

Успех авторів цієї роботи передусім пов’язаний із використанням тривалих клітинних культур, оскільки після багатьох пасажів у культурі клітин були відібрано малодифференцированные власні стовбурні клітини, які, мабуть, і було використані як донори ядер. Важливе значення також мав те що, що, враховуючи результати своїх попередніх робіт, синхронизировали стадії клітинного циклу яйцеклітин реципієнтів і клітин доноров.

Заключение

Итак, роботи з клонування хребетних розпочато на амфибиях на початку 1950;х років і інтенсивно тривають вже більше чотири десятиліття життя. Що ж до амфібій, те, як зазначалося, у відповідному розділі, попри значні досягнення, проблема клонування дорослих особин залишається досі пір не розв’язаною. Встановлено, що під час клітинної диференціювання у хребетних відбувається чи втрата певних генних локусів чи його необоротна інактивація. Очевидно, втрачається не та частина геному, яка контролює не ранні, ні тим більше пізні етапи онтогенезу, зокрема, метаморфоз амфібій. Механізм цього явища доки піддається науковому поясненню. Та, вочевидь, що з клонування дорослих хребетних необхідно використовувати малодифференцированные діляться клітини. Це методично важливе стан був враховано на більш пізніх работах.

В 1979 року американський біолог МакКиннел, котра внесла великий внесок у роботи з амфібіями, стверджував, що отримане результати неможливо серьерно говорити про можливість клонування людини [26] - тоді це здавалося недоступним для експериментальних эмбриологов. Проте ще той час багато вчених, письменники і навіть політики стали активно обговорювати возможностт клонування людини, а деякі дослідники навіть розпочали таким експериментам. Наприклад, Шеттлз повідомив, що пересадив ядро сперматогониальной клітини (диплоидного попередника зрілого гаплоидного спермія) в позбавлену ядра яйцеклітину людини [27]. Через війну три реконструйовані яйцеклітини почали роздрібнення, і виникли схожі на морулы скупчення клітин, які згодом деградували. Шеттлз думав, що й трансплантувати такі групи клітин на матку жінки, всі вони міг би нормально розвиватися. МакКиннел тоді справедливо заперечив, що таке припущення малоймовірно і немає необоснованно.

Еще 5−6 років тому ніхто учений, які працювало значна частина у цій галузі, не піднімав питання про використання як донорів ядер клітин дорослих ссавців. Роботи зводилися, переважно, до клонування ембріонів домашніх тварин, і з цих досліджень було невідь що успішні. Тому така вразило з’явився у початку 1997 року несподіване всім повідомлення авторського колективу під керівництвом Уилмута, що їм удалося, використовуючи соматичні клітини дорослих тварин, отримати клональное тварина — вівцю на прізвисько Доллі. Насправді, проте, дослідники пройшли довгий шлях, і Уилмуту з співробітниками довелося зібрати докупи всі які були на той час досягнення, як вони змогли повідомити про сенсаційне результаті своєї работы.

У цього першого успішного експерименту є значний недолік — дуже низький коефіцієнт виходу живих особин (0,36%), і з урахуванням також високий відсоток загибелі та розвитку реконструйованих яйцеклітин в плодовий період розвитку (62%), що у 10 разів більше, аніж за звичайному схрещуванні (6%), то йдеться про причинах загибелі зародків. Чи все пересаджені донорські ядра мали тотипотентностью? Зберігався цілком їх функціональний геном (набір генів, необхідні розвитку), чи всі потрібні розвитку гени були дерепрессированы? Це дуже важливі питання, й поодинці тварині не можна зробити остаточних висновків. Тим паче, що результати досліджень на амфибиях говорять про необоротному характері інактивації, репресії генів у ході клітинної диференціювання. Можливо, авторам неабияк пощастило, і вони досить випадково трьох різних клітинних популяціях відібрали за стислі терміни стовбурні клітини, котрим характерна низька дифференцированность та здатність до діленню. Заради підтвердження результат цієї, в буквальному розумінні с. енсационной роботи, необхідні додаткові исследования.

В найближчими роками головним завданням дослідників, що працюють у цій галузі - це, очевидно, створення культивованих in vitro ліній малодифференцированных стовбурових ембріональних клітин, що характеризуються високої швидкістю розподілу. Ядра саме таких клітин слід забезпечити цілковите дерегулювання та нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин, формування як морфологічних ознак, а й нормальних функціональних характеристик клонованого организма.

Исследования Уилмута і працівників мають як практичне, а й велику наукову значення для генетики розвитку. По суті, вони умови, у яких цитоплазма ооцитов ссавців може репрограммировать ядро соматичної клітини, повертаючи їй тотипотентність. Після тієї публікації цієї роботи відразу й широко став дискутуватися питання про можливість клонування людини. Щоб його обговорювати, можна буде виділити два аспекти: методичний і этический.

Из викладеного вище варто, що методично чи технічно клонування дорослих ссавців розроблено ще досить, щоб було вже нині ставити питання клонуванні людини. І тому необхідно розширити коло досліджень, включивши до нього. крім овець. представників інших видів тварин. Уилмут з працівниками, наприклад, планує продовжити свої роботи з корів і свинях. Такі роботи необхідні, аби з’ясувати, не обмежується чи можливість клонування дорослих ссавців особливостями чи специфікою будь-якого однієї чи кількох видов.

Затем необхідно істотно підвищити вихід життєздатних реконструйованих ембріонів і дорослих клонованих тварин, з’ясувати, не впливають чи методичні прийоми на тривалість життя, функціональні характерстики і плодючість тварин. Для клонування людини дуже важливо мінімізувати ризик, який, тим щонайменше, певною мірою однаково залишиться, ризик дефектного розвитку реконструйованої яйцеклітини, головна причина якого то, можливо неповне репрограммирование геному донорського ядра.

Что стосується етичної строны справи, клонування людини викликає більше заперечень. По-перше, становлення людину, як особистості, базується як на біологічної спадковості, він визначається також сімейної, соціальної й нерозривності культурної середовищем. При клонуванні індивіда неможливо відтворити всі ті умови виховання і навчання, які сформували особистість його прототипу (донора ядра). По-друге, при бесполом розмноженні спочатку жорстка запрограмованість генотипу визначає менше розмаїтість взаємодій що розвивається організму з изменяющимися умовами середовища (по порівнянню з статевим розмноженням, коли у формуванні індивіда беруть участь двоє геному, складним; і непередбачуваним чином взаємодіючі між собою й навколишнім середовищем). По-третє, майже всі релігійні вчення наполягають, що особи на одне світло — в «руках «Вищих Сил, що зачаття і народження має відбуватися природним путем.

Подводя підсумки, можна припустити, що казати про клонуванні людини, можна суто теоретично. По суті йдеться щодо клонуванні, йдеться про отриманні копії окремого індивіда, оскільки термін «клонування «передбачає отримання якогось безлічі особин. Але слово вже прижилося, тому можна буде користуватися ним як раніше. Вочевидь, що сьогодні ймовірність негативних наслідків цієї процедури значно переважує її вигоди, тому, з мого глибоке переконання, роботи з клонування людини, як і час, і у недалекому майбутньому проводити нецелесообразно.

Возможно, згодом, якщо будуть удосконалені все етапи цього складного біотехнологічного методу, вчені, соціологи та інші зацікавлені особи зможуть повернутися до обговорення доцільність клонування людини. Проте цей час, гадаю, настане нескоро, і у будь-якому разі вирішення питання клонуванні тієї чи іншої людини буде регламентуватися суворими рамками і правилами, торкаючись, можливо, лише окремих медичних проблем, скажімо непереборного іншими методами бесплодия.

В той час, роботи із домашніми тваринами дуже важливі із практичною точки зору. Клонування цінних трансгенних тварин може швидко й економно забезпечити людство новими лікарськими препаратами, які у молоці, спеціально отриманих при цьому генноинженерными методами овець, кіз чи корів. Клонування високопродуктивних свійських тварин, зокрема, молочних корів, може оцінити буквально революцію у сільське господарство, оскільки лише цим методом можна створити непоодинокі екземпляри, а цілі стада елітним коровам рекордисток. Це саме можна сказати до розмноженню видатних спортивних коней, цінних хутрових звірів, збереженню рідкісних і зникаючих тварин за природних популяціях і т.д.

Новые технології, безперечно, корисні людству, та його необхідно всіляко заохочувати. Заборони потрібні тих в крайніх випадках, коли явно проглядається шкода чи збитки здоров’ю та епідемічного благополуччя людей. Поки клонування людини, можна зарахувати до цьому розряду. Моральна сторона проблеми, тим щонайменше, вже коштує на повний зріст. Нестримно оптимістичну позицію, як здається, займають лише люди, погано знають питання. Тим, далі - хтозна його, ясно: переносити ще решенную методично наукову розробку на людини аморально. Федерація наукових товариств експериментальних біологів США — але це більш 52 тис. членів — у жовтні 1997 року оголосила п’ятирічний мораторій на експерименти клонування людини. Адже вони розуміють участь безлічі конкретних осіб, які захочуть дати свої клітини, і сурогатних матерів, які мають виносити плід. Якщо ж велика кількість ушкоджень ембріонів і мертворождений, якщо неясний взагалі кінцевий результат, етично чи навіть казати про перенесення експерименту на живих людей? Понад те, знайдуться аморальні люди, що під маркою допомоги безплідним парам, приміром, почнуть обманіть великі гроші, що скомпрометує самої ідеї, науковий поиск.

Я зовсім не від заперечую те, що у майбутньому, коли проблема буде цілком вирішена методично, людство визнає клонування як засіб допомоги безплідним парам, хто прагне мати рідного їм дитини. Хоча що казати, скоріш, треба буде щодо дитині узагалі, а про однояйцевом близнеце батька чи матері, яким буде клонований дитина в біологічному сенсі. Але тоді тим паче знадобиться заздалегідь вирішити етичні і юридичні питання, як це було для трансплантації органів у багатьох країн світу. Норми біоетики висуваються нині першому плані. Ті моральні заповіді, якими людство користується століття, на жаль, не передбачають нових закономірностей і можливостей, які вносить у життя наука. Тому людей і необхідно обговорювати і вчасно приймати нових законів гуртожитки, враховують нові реальності.

Клоны з изменённой ДНК.

Ну ось і трапилося те, якого довго чекали і не чого дехто боялися. З’явилося повідомлення, що в учених з вже знаменитої своєї вівцею Доллі шотландської фірми PPL Therapeutics (комерційного відділення Розлин Інституту в Единбурзі) удалося одержати успішні клони овечок зі зміненою ДНК. Шотландські вчені спромоглися об'єднати клонування, у якому генетичний матеріал клона був «підправлена «з кращу сторону.

Но як продовжувати сурмити в фанфари, трохи истории.

Если пам’ятаєте, усе з овечки Доллі, що була клонирована 1996 року вченими з тієї ж шотландської лабораторії, як і сьогоднішні овечки. Термін «клонування «означає вирощування з соматичної, нестатевий клітини точною генетичною копії матері. Клітина дорослої вівці зливалася з взятій у інший вівці яйцеклітиною, з якої попередньо було віддалене ядро, що містить спадкову інформацію. Цитоплазма яйцеклітини і ядро дорослої клітини з'єднувалися на своєрідне подобу заплідненої яйцеклітини. З неї вирощувалося ембріон, які вже имплантировался третьої вівці. Тобто разі з Доллі був «обійдений «статевої процес пов’язана з ним роль випадку при комбінуванні спадкових задатків. Наприклад, у Доллі - біла морда финско-дорсетской породи (від генетичної матері), хоча у неї виношена черномордой шотландської яскравою. Після цього відкриття почалися численні випадки «іншого «клонирования-копирования. Чимало їх ми, тим більше ж назві, тим щонайменше не повторюють експерименту з Долли.

Есть до цієї пори кілька проблем, що з Доллі. Перша, судячи з усього, успішно дозволена. Вона у цьому, що Доллі була єдиним клоном, отриманим шотландськими вченими. Клонів було кілька десятків. У живих залишилася лише одне Доллі. Але за чотири роки, які з народження, судячи з усього, ученим пощастило настільки відшліфувати техніку клонування, що, шлюб став мінімальним. Пишу так обережно, бо ні зустрічав конкретних цифр смертності різних клонів. Це зрозуміло — хто ж саме захоче розписувати власні невдачі. Проте, по непрямим даним, навіть якщо нього й залежить існує, він так великий, як у з Доллі. (Судячи з повідомлень інформаційних агентств, у цьому експерименті було імплантовано 80 ембріонів, їх 14 народилося, три вівці дожили до шестимісячного віку. Результат набагато краще, ніж із Долли.).

Вторая проблема набагато серйозніше і масштабніші, з наукової погляду. Попри все переможні фанфари що стосується Доллі, досі не залишається її вік і пов’язані з нею проблеми. Річ у тім, що, можливо, вік шестирічної матері бо так «запам'ятався «у її клітинах, що час народження Доллі ВЖЕ була немолодої особливої. Тому така важлива була чергова спроба учених створити за методикою копіювання Доллі когось другого.

В разі роботи доктора Чикара Кубота з Kogashima Cattle Breeding Development Institute й доктори Джеррі Янга з Animal Transgenic Facility університету Коннектикута що це клітини з вушний раковини 17-річного призового бика, з чого склався шість телят. У грудні 1997 року Янг і Кубота взяли зразки клітин та розмістили їх у сприятливе середовище, причому було зупинено їх розподіл. Потім із клітинами було пророблено така сама операція, що з Доллі. Але! Пересадка ядра з генетичної інформацією було здійснено не відразу, а два місяці щодо одного разі і крізь місяці й інші. Чотири теляти народилися у грудні 1998 року, два — у лютому 1999 року. Причому, що більше клітини «маринувалися «у пробірці, тим стрімкіше був їхній розвиток у материнському лоні. Отже, ученим пощастило показати, що може бути не смертельний перерва у «зборі «і «пересаджування «клітин до приймальні матери.

Этот експеримент цікавий і тих, що, як вже нині зрозуміли, біологічний вік бичків з вушний раковини МОЛОДШИЙ, ким мусив бути прибутковим і з біологічним віком клона дозволена теоретично. Залишилося тільки підібрати їй надійне практичне решение.

Вот таким «полі битви «наукових відкриттів й ідей до останнього часу. У цьому тлі шотландські вчені оприлюднили іще одна, революційний, крок уперед. Що пощастило, й що получилось?

На останнє запитання відповісти просто — три вівці, хто був народжені у минулому року і досі пір живі. Дві (Купид і Діана) їх мають ген, що дозволяє їм виробляти молоко із білками, як і в людини. Третя немає зміненого геному і є контрольним экземпляром.

Из 80 ембріонів, як я згадував, вижило лише три. Вчені пов’язують такий відсів ні з генетичними модифікаціями овечок, і з тими самими труднощами при клонировании.

Что вдалося шотландським вченим та как?

Вообще-то впровадження «чужорідних «генів у ДНК тварин — непоодинокі. Не рідкість — навіть упровадження їх у статеві клітини до запліднення. Але це дозволяє за потрібне ознаками зберегтися у дитини. На противагу цим роботам, шотландським ученим пощастило виробити методику впровадження чужорідних генів у клітину вівці до її пересадки в яйцеклітину вівці-донора і наступного отримання точної копії істоти із «потрібними свойствами.

Был впроваджений ген, який благополучно пройшов безліч перевірок і тепер додає в молоко овець «лікувальний «фермент, вживаний у сучасної фармакології на лікування спадкової эмфиземии — хвороби легких. Отож, пийте люди молоко — дихайте глубоко…

Директор фірми PPL Therapeutics Алан Колман стверджує, що «значення такий методики у тому, що ми тепер можемо вибирати до народження гени, які хочемо змінити чи видалити » .

Чем нам це здійснення грозит?

Улучшенными властивостями клонов.

Клонами зі властивостями, корисними для человека.

Возможностью вирощувати для пересадки людські органи всередині, наприклад, свиней. Причому, по заданим параметрами і з не меншою ймовірністю відторгнення. Вчені планують отримати генетично модифіковані клони свиней вже наступного году.

Клонированные поросята.

В березні 2000 р., все той самий PPL Therapeutics оголосила у тому, що їх дослідницькому центрі народилися п’ять клонованих поросят.

Клонирование свині складніша операція, ніж клонування вівці або корів, оскільки для здобуття права підтримувати одну вагітність необхідно дещо здорових плодів. Органи свині найбільш підходять до людини за величиною. Свині легко розмножуються і відомі своєї невибагливістю. Та найбільшою проблемою залишається відторгнення органу тваринного, який людський організм не приймає на власний. Саме у цьому напрямі розвиватимуться подальші дослідження учених із Розлин Інституту. Вчені бачать одне із можливих шляхів розв’язання проблеми у цьому, щоб генетично «замаскувати «органи тваринного, у тому, щоб людський організм було розпізнати їх як чужі. Увага учених зосереджено на вивченні гена під назвою «alpha 1−3 gal transferase », відповідального за відторгнення чужорідних тканин імунної системою человека.

Еще однієї темою на дослідження є намагання «олюднити «генетичним шляхом органи свині, щоб значно знизити ризик відторгнення. І тому передбачається вводити людські гени в хромосоми клонируемых свиней.

Той ж завданням, але не матимуть застосування клонування, займаються й інші інститути. Наприклад, компанія «Imutran », розташована у Кембриджі, змогла отримати ціле стадо свиней, в генетичному наборі яких відсутня одна із ключових характеристик, відповідальна за відторгнення чужорідних тканин. Як тільки отримана пара чоловічої та жіночої особини, вони готові виробляти світ «генетично чисте потомство », з органами, які можна використовувати для трансплантации.

Да… зовсім забув сказати — клонувати людину що ніхто не зміг. І йдеться над відмінність його від вівці. Просто далеко не всі зважиться експериментувати з 80 ембріонами людини, щоб потім отримати трьох шестимісячних немовлят. Простіше вирощувати потрібні нас органи у череві свиньи.

Клонирование людських эмбрионов.

Уже у вересні батьківщині вівці Доллі то, можливо клонирован перший людський ембріон. Уряд Великобританії має офіційно озвучити умови та вимоги на проблеми «терапевтичного «клонування людських істот. Йдеться створенні ранніх ембріонів — свого роду банку донорських тканин для конкретних индивидуумов.

Стволовые клітини (спрощено — клітини ранніх людських зародків) давно в центрі уваги медицини через своїх унікальних особливостей. У цих клітинах ще працюють первобытно-мощные таємничі гени, які назавжди «замовкають «у клітинах дорослої людини. Потенціал зростання стовбурових клітин просто фантастичний — згадати, що триллионноклеточный організм новонародженого людини утворюється з однієї-єдиної клітини всього лише над 9 місяців! Але ще більше вражає потенціал диференціювання — сама й той самий стволовая клітина може трансформуватися на будь-яку (!) клітину людини, чи це нейрон мозку, клітина печінки чи серцевий миоцит. «Дорослим «клітинам така трансформація за силам.

Еще одне властивість цих клітин перетворює в воістину безцінний об'єкт для медицини. «Чужі «власні стовбурні клітини, введені до організму людини, відкидаються значно слабшими, ніж пересаджені цілі органи, які з вже диференційованих клітин. Це означає, що у принципі можна вирощувати в лабораторних умовах попередники найрізноманітніших клітин (серцевих, нервових, печінкових, імунних та інших.), і далі трансплантувати їх тяжкохворим людям замість донорських органів.

Список литературы

Для підготовки даної праці були використані матеріали із сайту internet.