Основні результати та їх обговорення

Мутабільність ліній lozenge Drosophila melanogaster.

В роботі використано серію ліній lozenge (lz) D. melanogaster, які походять від генетично нестабільної лінії lz^75V, виділеної з природної популяції Далекого Сходу. Роботами Голубовського та Волошиної показано, що висока мутабільність алеля lz^75V обумовлена інсерцією в нього Р_елементу [Голубовский и Волошина, 1990]. Досліджувані лінії були розділені на 4 фенотипові класи, які перечислені в порядку підсилення фенотипового прояву: lz⁺, lz^sl, lz^75V та lz^ex. До кожного з класів відносився ряд алелів, які виникли незалежно. На основі аналізу частоти виникнення спонтанних мутантів виділено дві групи ліній: стабільні та нестабільні, відмінності між якими тісно пов’язані з алельним станом гену lz (табл. 1). Генетично стабільними виявилися лінії з фенотипом lz⁺ та лінії з максимальним вираженням гену lz — lz^ex. Серед потомків цієї групи ліній не було виявлено жодного мутаційного переходу по гену lz, а поодинокі мутаційні події відбувалися за його межами. До другої групи належали нестабільні лінії з алелями lz^sl та lz^75V, які відрізнялися між собою за рівнем і напрямом мутування. Кожен алель володів певним спектром мутацій; найчастіше фіксувалися мутаційні переходи до lz⁺. Описаний новий алель, позначений нами як lz^ss (lozenge super strong), який за фенотипом близький до lz^ex, однак відрізняється від нього темно-червоним кольором ока. Серед потомків досліджених ліній, крім повних мутантів, виявлені соматичні мозаїків по в генах rough (rou) та lz. Частота виникнення мутацій в соматичних клітинах була низькою і не залежала від алельного стану гену lozenge (табл. 1). Тест на комплементацію показав, що всі досліджені алелі lz відносились до однієї групи комплементації, а всі мутаційні події відбувалися в сублокусі glossy складного локусу lozenge.

Пов’язуючи нестабільність досліджуваних ліній з активністю Р_елементу в локусі lozenge логічно було припустити, що мутації, які виникали de novo, були наслідком Р — М гібридного дисгенезу. На основі результатів схрещуваня з лінією ₂ (сильна Р-лінія) показано, що лінія з алелем lz^75V.1L поводить себе як М-лінія, демонструючи високий рівень стерильності при 25^оС і статистично достовірне зростання цього показника при 29^оС. В той же час у гібридних самок, які несли Х-хромосому з алелем lz^75V.1L від нестабільних ліній lz^75V.1L (88.5), y lz^75V.1L (89.1) та sn^ex lz^75V.1L (91.1) в компаунді з Х-хромосомою М-лінії y ct v f, теж виявлено високий (90% і вище) відсоток стерильності вже при 25^оС, що свідчить про відсутність характерних проявів Р-М гібридного дисгенезу.

З метою вивчення впливу аутосом на мутабільність гену lz у лінії lz^75V.1L була проведена заміна другої хромосоми на хромосому лабораторної лінії black. Частота виникнення мутантів у отриманої лінії lz^75V.1L b (89.3) різко зросла, що свідчило про вплив на частоту мутування досліджуваного алелю генетичних елементів другої хромосоми лінії black; спектр мутацій при цьому залишався незмінним. У стабільних ліній lz⁺ та lz^ex заміна 2-ї хромосоми не приводила до зміни рівня мутабільності. Щоб встановити, чи наявні регуляторні елементи в Х_хромосомі, проаналізовано ряд ліній lz, отриманих в результаті рекомбінаційних замін ділянок Х^75V — хромосоми на ділянки Х-хромосоми лабораторних ліній yellow та y ct v f. Показано, що в дистальній частині Х^75V — хромосоми присутні фактори, необхідні для підтримання нестабільного стану гену lozenge, тому що їх елімінація шляхом рекомбінації суттєво знижує мутабільність похідних від lz^75V нестабільних алелів. На основі аналізу рекомбінантів, одержаних в результаті схрещування мух ліній lz^75V (88.3) і y ct v f виявлено, що у 64,32% особин класу рекомбінантів ct — lz спостерігалося суттєве послаблення прояву алелю lz^75V — фенотип був близький до lz^В. Фенотип lz^В не зустрічався cеред основних класів та інших типів рекомбінантів, тому можна було припустити, що він виник в результаті впливу на алель lz^75V певного генетичного елементу, розташованого в Х-хромосомі на ділянці між генами ct i lz. Оскільки відбувалася супресія алелю lz^75V, даний генетичний елемент був позначений нами як su (lz^75V) і локалізований в положенні 1−22.7 одиниць карти (табл. 2).

Аналіз потомства в системі схрещування lz^75V /y ct v f y ct v f.

З метою дослідження взаємозв'язку між мутуванням гену lz та інших нестабільних генів Х-хромосоми в дистальну частину Х-хромосоми лінії lz^75V.1L шляхом рекомбінації були введені ділянки хромосом нестабільних ліній sn^ex lz⁺ та y² w^a4. Синтезовані та похідні від них лінії містили в Х-хромосомі у різних комбінаціях два або чотири нестабільні алелі з інсерціями МГЕ (рис. 1). Нестабільними у даних ліній залишалися алелі lz^75V.1L та lz^sl.4L. Відмічено достовірне зростання рівня мутування алелю lz^75V.1L в присутності алелів carmine та singed^f. Серед інших генів Х-хромосоми найчастіше мутації в генеративних та соматичних клітинах виникали в локусі sn (sn⁺ sn^ex, sn⁺sn^f). Таким чином, у всіх проаналізованих ліній відмічена висока локусоспецифічність мутаційних подій; мутації відбувалися, як правило, в генетично нестабільних локусах, які містили інсерції МГЕ. Основну кількість мутантів складали мутаційні переходи по гену lozenge. Відмічене зростання частоти мутуваня гену lozenge при зміні генетичного оточення.

Вплив рентгенівського опромінення на мутабільність ліній D. melanogaster з різним алельним станом гену lozenge.

У групи ліній lozenge методом обліку домінантних летальних мутацій досліджено вплив РО сумарною дозою 30 Гр. Кожна з проаналізованих ліній в контролі володіла індивідуальним рівнем ДЛМ, який зазнавав статистично достовірного зростання в потомства F₁ після опромінення. Кореляції між рівнем нестабільності ліній, алельним станом гену lozenge та рівнем ДЛМ не було виявлено. Отримані результати свідчили про те, що використана в експерименті доза РО є мутагенною для даної групи ліній D. melanogaster. Власне доза 30 Гр була використана при дослідженні частоти виникнення та спектру індукованих РО мутантів у ліній lozenge. Як і в контролі (при визначенні спонтанного рівня мутування), стабільними виявилися лінії з алелями lz⁺ та lz^ex, а поодинокі мутаційні події відбувалися за межами локусу lozenge (табл. 3). У нестабільних ліній з алелями lz^sl та lz^75V частота мутування в F₁ після дії РО достовірно зростала у всіх випадках. Звернули на себе увагу розширення та зміна спектру алелів lz, які виникли de novo і складали основну масу мутантів, а також виникнення мутацій в інших генах — yellow, white, carmine, rou, які в контролі не фіксувалися. Разом з тим опромінення дозою 30 Гр не приводило до зміни частоти виникнення соматичних мозаїків у досліджуваної групи ліній, за виключенням лінії lz^75V.1L, у якої цей показник достовірно перевищував дані при спонтанному мутуванні (табл. 3).

В ході наступних експериментів був проаналізований вплив РО на частоту виникнення генеративних мутантів та соматичних мозаїків у ряду ліній, які в Х_ хромосомі несли інші нестабільні гени (рис. 2). Використані сумарні дози 3 Гр, 10 Гр та 30 Гр. Аналіз проводили на протязі 3−5 поколінь. Хоча кожна лінія мала певні індивідуальні особливості, були встановлені загальні закономірності радіоіндукованої відповіді. У всіх досліджених ліній частота виникнення мутантів зросла вже в F₁ у порівнянні з контролем і зберігалася на високому рівні протягом декількох поколінь. Однак, опромінення сумарною дозою 30 Гр зумовлювало ширший спектр мутаційних подій і тривалішу в часі дестабілізацію генів, ніж дія 3 Гр і 10 Гр. Відмічена висока локусоспецифічність виявлених de novo мутацій: основна їх кількість виникала в локусі lozenge, та інших локусах Х-хромосоми — yellow, white, singed, які містили інсерції МГЕ. Таким чином, одержані результати свідчать про те, що нестабільні гени Drosophila можуть служити маркерами при дослідженні впливу РО.

Активність та електрофоретичний спектр фенолоксидази На рис. 3 представлені електрофоретичні спектри фенолоксидази личинок, лялечок та імаго Oregon_R D. melanogaster при активації метанолом, етанолом та 2_пропанолом. Прояв фракцій фенолоксидази на електрофореграмах свідчив про те, що використані спирти по-різному впливають на активацію проферментів ФО на передімагінальних стадіях (у личинок третього віку і 24-х годинних лялечок): етанол і 2_пропанол активують A₁ та A₃ компоненти, а метанол активує всі три фракції - A₁, A₂, A₃ (при цьому максимальною активністю володіє фракція A₃). Для одноденних імаго при активації різними спиртами характерною була присутність на електрофореграмах тільки однієї фракції A₁. Аналогічний прояв компонентів ФО-комплексу в процесі онтогенезу був виявлений і у всіх інших досліджених нами ліній D. melanogaster. На основі електрофоретичних досліджень, проведених через день на протязі 25 днів життя імаго, показана відсутність генотипових, статевих і вікових відмінностей; у всіх зразках виявлявся тільки A₁_компонент фенолоксидазного комплексу.

На основі аналізу електрофоретичного спектру ФО у ліній дикого типу та ряду лабораторних ліній нами виявлено поліморфізм за фракцією A₁. F (Fast)-форма була присутня у ліній Анапа та y w, а S (Slow) — у всіх інших досліджених ліній. У гібридів F₁ від схрещування y w b cn vg проявлялись три смуги активності фракції A₁: по одній смузі, характерній для вихідних батьківських форм, і смуга з проміжною рухливістю (рис. 4). На основі цього був зроблений висновок, що компонент A₁ фенолоксидазного комплексу є димером, субодиниці якого in vivo вільно комбінуються, формуючи гібридну молекулу.

Для встановлення групи зчеплення гену, який кодує субодиниці А₁_компоненту ФО, ми використали методику отримання експериментальних ліній D. melanogaster з ізогенізованими хромосомами. Внутрішньохромосомна локалізація гену Dox-A1 проведена на основі електрофоретичного аналізу рекомбінантних особин, отриманих в результаті аналізуючого схрещування між лініями Анапа і b cn vg (табл. 4). Структурний ген Dox_A1 локалізовано нами в другій групі зчеплення в положенні 67.3 од. карти. З метою визначення рівня експресії гену Dox-A1 нами спектрофотометричним методом була досліджена активність фенолоксидази у ліній з різними алельними станами гену lozenge. Виявлені достовірні міжлінійні відмінності у рівні активності ферменту. Встановлена кореляція між алельним станом гену lz і активністю ферменту (табл. 5). Група ліній lz⁺ характеризувалася найвищою ферментативною активністю. У більшості ліній з фенотипом lz^sl та lz^75V рівень активності ферменту був знижений, а у lz^ex — мінімальний. Вікова динаміка активності ФО мала таку спрямованість: найвищою активністю володіли одноденні мухи, протягом перших п’яти днів життя активність ферменту знижувалась і надалі стабілізувалась. У самок цей процес відбувався поступово і специфічно у окремих ліній, причому чіткі міжлінійні відмінності зберігалися до 20 дня життя. У самців всіх досліджених ліній вже на 5 день спостерігався різкий спад активності ферменту, і в період з 5 по 20 день підтримувався той мінімальний рівень фенолоксидази, який, очевидно, необхідний для нормального функціонування захисної системи у дрозофіли. Високий рівень активності фенолоксидази у самок в репродуктивний період може бути пояснений потребою в цьому ферменті для утворення поліфенольних оболок яєць. Виявлена позитивна кореляція (r=0,955) між рівнем активності фенолоксидази у самок в репродуктивний період і їх фертильністю. Самки ліній, у яких активність ФО в репродуктивний період є високою, характеризуються високою фертильністю (більше 90%), тоді як самки ліній з низькою ферментативною активністю, мають низьку фертильність (менше 10%).

Результати рекомбінаційного картування локусу Dox-A1.

З метою дослідження впливу генетичних елементів Хта 2 хромосом на активність ФО була проведена заміна 2 хромосоми та ділянок Х_хромосоми у ряду ліній з різними алельними станами гену lz. Визначена активність ФО у рекомбінантів, одержаних в результаті схрещування між лініями lz^75V і y ct v f. Вихідні лінії достовірно відрізнялися за рівнем активності ферменту у одноденних імаго. Заміна у лінії lz^75V ділянки Х-хромосоми від yellow (1−0.0) до cut (1−20.0) приводила до достовірного зростання активності фенолоксидази; заміна Х_хромосоми на ділянці від vermillion (1−33.0) до forked (1−56.7) ніяких змін не викликала. На підставі цих даних ми припустили, що регуляторний генетичний елемент, який впливає на рівень активності ферменту, розміщений у проксимальній ділянці Х_хромосоми і тісно зчеплений з геном yellow. Надалі була досліджена фенолоксидаза у лінії y² w^a4 sn^+3L lz^75V.1L, яка характеризувалася високою активністю ферменту. Встановлено, що мутаційні переходи lz^75V.1L lz⁺ не приводили до змін у функціонуванні ФО. Разом з тим реверсія гену yellow до норми (y² y⁺) в присутності алелю lz^75V.1L знижувала активність ферменту до рівня ліній lz^75V, а реверсія гену lozenge (lz ^75V.1L lz⁺) при наявності алеля y⁺ вела до відновлення високого рівня активності ферменту. Одержані результати свідчили про регуляторний вплив на активність ФО в присутності алеля lz^75V.1L власне гену yellow. При заміні 2-хромосоми від темнопігментованої лінії black cпостерігалось підвищення активності ФО у ліній з алелями lz^sl та lz^75V. У ліній lz^+1L та lz^ex.1L перебудови геному за межами Х-хромосоми не викликали змін у функціонуванні ферменту.