Заняття 8. Визначення концентрації сперматозоїдів у спермі

Мета заняття. Навчитись визначати концентрацію сперматозоїдів в 1 мл сперми та загальну їх кількість еякуляті.

Питання:

• 1. визначення концентрації статевих клітин в 1 мл еякуляту за допомогою камери Горяєва; оптичних стандартів; фотоелектроколориметром (ФЕК);
• 2. провести розрахунок загальної кількості сперматозоїдів в еякуляті.
• а) Теоретична частина

Концентрація сперміїв — це їх кількість в одиниці об'ємів. Вона визначається в мільярдах або мільйонах різними методами: в камері Горяєва; за допомогою стандартів, розроблених Г. В. Паршутіним і Е. Ю. Румянцевою; фотоелектроколориметром (ФЕК).

Найбільш простим та доступним для визначення концентрації сперміїв є метод за допомогою фотоелектроколориметра. Принцип роботи приладу полягає в тому, що на червоному світлофільтрі через кювету з досліджуваною спермою пропускають пучок світла, який потрапляє на фотоелемент, з'єднаний з гальванометром.

На шкалі приладу величина відхилення стрілки обернено пропорційна концентрації сперміїв. Кількість сперматозоїдів в досліджуваній спермі визначають за попередньо складеною градуювальною кривою.

Рис. 15. Лічильна камера Горяєва:

• 1 — скло камери;
• 2 — опорні площадки;
• 3 — роздільні колобки;
• 4 — накривне скельце;
• 5 — сітка Горяєва.

Концентрація сперміїв можна визначається також за допомогою камери Горяєва. Лічильна камера являє собою пластину з товстого скла з нанесеними на неї поперечними колобками (3), що утворюють три площадки (рис. 15).

• 1 — великий квадрат;
• 2 — малий квадрат.

Середня площадка (рис. 15) повздовжнім колобком розділена на дві, на кожній з яких вигравірувані дві сітки (5), що складаються з малих та великих квадратів. На 0,1 мм вище середньої площадки по обидві сторони від неї розміщені дві опорні площадки (2), на які щільно притирається накривне скло (4) до появи в місці стикання скелець райдужних (Ньютонових) кілець. Таким чином, між середньою площадкою і покривним склом утворюється щілиноподібний капілярний простір — це і є камера, що наповнюється спермою.

При роботі з камерою її робочі поверхні повинні бути чистими і сухими.

Сітка Горяєва (рис.16) складається з 225 великих квадратів, 25 з яких розграфлені на малі квадрати (по 16 разом). Підрахунок кількості сперміїв проводиться по діагоналі сітки Горяєва в 80 малих квадратиках.

б) Практична частина

Завдання. Підрахувати кількості сперміїв у лічильній камері Горяєва.

Матеріали та обладнання: сперма; мікроскопи; лічильні камери; меланжери для підрахунку лейкоцитів; шліфовані накривні скельця; 3% розчин хлористого натрію; дистильована вода; спирт; фільтрувальний папір.

Хід роботи. Перед початком роботи лічильну камеру та накривне скельце протирають чистою сухою серветкою і притирають накривне скельце до опорних площадок до появи райдужних кілець Ньютона.

На верхній кінець змішувача одягають гумову трубку. Набирають в нього розморожену сперму бика до відмітки 0,5. Потім в цей же змішувач додають засмоктуванням 3% розчин хлористого натрію до відмітки 101.

В гіпертонічному розчині хлористого натрію спермії стають нерухомими, що полегшує їх підрахунок. Затискують два кінці змішувача і струшують його протягом 1−2 хвилин. Коли сперма рівномірно змішалась з розчином, 2−3 краплини її випускають щоб виділити з піпетки розчин, не змішаний з спермою.

Наступну краплю сперми швидко наносять на край накривного скельця. Переносять камеру на предметний столик мікроскопа і підраховують кількість сперматозоїдів при збільшенні в 400 разів. В полі зору вміщується один великий квадрат.

Сперматозоїдів підраховують у 80 малих квадратах, тобто у 5 великих. Рахують тільки ті спермії, головки яких лежать всередині квадратів або розміщені на верхній і нижній межі квадрата, не звертаючи увагу на розміщення їх хвостів (рис. 17).

Для більш високої якості визначення концентрації статевих клітин їх рахують в камері два рази. Після закінчення підрахунків додають кількість сперміїв в п’яти великих квадратах.

Рис. 17. Порядок підрахунку сперматозоїдів

Концентрацію © сперматозоїдів визначають за формулою:

.

де.

n — число підрахованих сперміїв;

D — ступінь розбавлення;

P — глибина лічильної камери (0,1 мм);

H — кількість малих квадратів, в яких проводився підрахунок.

Число 400 введено для перерахунку на квадратні міліметри, а 1000 — для перерахунку на мілілітри.

Наприклад, в першому великому квадраті нараховано 23, в другому — 31, в третьому — 35, в четвертому — 40, в п’ятому — 37, а в п’яти великих квадратах 166 сперміїв. Якщо сперму набирали в змішувач з червоною бусинкою (еритроцитарний) до відмітки 1,0, то отриману суму ділять на 200. При розведенні сперми в лейкоцитарному змішувачі сперму набирають до відмітки 0,5 і суму ділять на 100.

Наприклад, при підрахунку сперми бика, розбавленої в 200 раз в великих квадратах, нараховано 240 сперміїв, тоді загальна їх кількість дорівнює.

Після закінчення роботи камеру Горяєва, накривне скельце та змішувач промивають спочатку водопровідною водою, а потім дистильованою і витирають м’якою сухою серветкою.

Отримані результати записують у робочий зошит і роблять висновок по концентрації сперміїв.

Метод визначення концентрації сперматозоїдів за допомогою камери Горяєва найточніший. Проте у виробничих умовах ним користуються не завжди, оскільки для підрахунку потрібно багато часу.

Тому використовують більш швидкі методи визначення концентрації статевих клітин: ФЕК (фотоелектроколориметр — прилад для визначення речовин в розчині за величиною поглинання монохроматичного світла), оптичних стандартів і стандартів мутності (каламутності).

Питання для самоконтролю

• 1. Що таке концентрація статевих клітин.
• 2. Що покладено в основу визначення густини сперми.
• 3. Які є методи визначення концентрації сперматозоїдів.
• 4. Як визначається концентрація сперматозоїдів в ФЕК.
• 5. Як визначається концентрація сперматозоїдів в камері Горяєва.
• 6. Які мінімальні показники концентрації статевих клітин в свіжоотриманій спермі плідників — бугая, кнура, барана, жеребця.