Мікробіологічний синтез глутамінової кислоти

Глутамінова кислота в значних кількостях присутня в мікробних клітках і бере участь в утворенні різних продуктів їх метаболізму. Глутамат натрію широко використовують як приправи до їжі, а глутамінову кислоту застосовують для лікування трофічних порушень обміну речовин. Для виробництва L-глутомата використовують культури Brevibacterium. Оптимальним є використання середовища, що містить 10% глюкози, накопиченню L-глутомата сприяють енергійна аерація і перемішування, середня температура інкубації 300, рН 6,0−8,0. У культуральну рідину періодично додають сечовину. Як джерела цукру використовують сирий гідролізат деревини і мелясу. Всі бактерії потребують біотвані як чинника зростання і вихід L-глутомата в їх культурах залежить від концентрації біотвань в середовищі.

Схема біосинтезу L-глутомата [3, c.12].

Глутамінова кислота грає вельми важливу роль в обміні речовин організмів, оскільки лежить на дорогах синтезу різних з'єднань.

Мікробіологічний синтез лізину, метіоніну, треоніну і ізолейцину

Білки зерна, пшениці, ячменю, кукурудзи і інших злакових культур не збалансовані за змістом незамінних амінокислот і, перш за все, лізину. Тому для задоволення потреб тваринництва в лізині в нашій країні і низці інших країн організовано його великомасштабне виробництво. У основу виробництва покладені технології з використанням одноступінчатого мікробіологічного синтезу, які включають промислове культивування мутантів ауксотрофів бактерій з роду Corynebacterium, здібних до надсинтезу цієї амінокислоти. Зазвичай в диких штамів, з яких отримані мутанти ауксотрофів, надсинтезу лізину не спостерігається, оскільки у них діють механізми саморегуляції. У клітках бактерій амінокислота лізин синтезується з аспарагінової кислоти через ряд проміжних етапів, пов’язаних з утворенням напівальдегіду аспарагінової кислоти, дигідропиколиної кислоти, що є безпосереднім попередником лізину. апівальдегід аспарагінової кислоти є також одним з попередників в синтезі амінокислот — треоніну, метіоніну і ізолейцину (схема 1). Процес синтезу амінокислот (лізину, треоніну, метіоніну і ізолейцину) починається фосфорилуваням аспарагінової кислоти за участю аллостеричного ферменту аспартаткінази, активність якого інгібується спільною дією двох амінокислот — лізину і треоніну, якщо вони накопичуються в клітках бактерій в надлишковій концентрації. Якщо знизити концентрацію однієї з цих амінокислот, то синтез інший здійснюватиметься навіть за умови, коли вона накопичується в досить високій концентрації.

Схема 1 [1,c.37].

Для зняття регуляції синтезу лізину необхідно припинити утворення треоніну на стадії перетворення напівальдегіду аспарагінової кислоти в гомосерін, що каталізує ферментом гомосеріндегидрогеназою. Останнє досягається за допомогою мутагенезу.

Досліди показують, що клітки мутантів, не створюючі гомосеріндегідрогенази, при їх культивуванні на штучному живильному середовищі забезпечують високий вихід лізину. Дефіцитні амінокислоти, які не синтезуються клітками (гомосерін, треонін, метіонін) мутантів, вводяться до складу живильного середовища в такій кількості, аби вони не були регулювальниками синтезу лізину. В процесі приготування живильного середовища для культивування виробничих штамів мутантів ауксотрофів, що володіють здібністю до надсинтезу амінокислоти лізину, як джерело вуглецю зазвичай використовують суміші, що включають оцетову кислоту і бурякову мелясу, як джерело азоту — солі амонію, сечовину, кукурудзяний екстракт, гідролізат дріжджів.

Окрім дефіцитних амінокислот, які не синтезуються клітками мутантів, в живильне середовище також додають необхідні для життєдіяльності мікроорганізмів макроі мікроелементи і вітаміни. В процесі культивування мікроорганізмів забезпечується подача стерильного повітря за допомогою спеціальних турбінних мішалок, для запобігання спінюванню субстрату і клітинної суспензії в середу культивування додають піногасник. Посівний матеріал, призначений для виробничої ферментації, спочатку вирощують в посівних апаратах при 28−32С, рН 7−7,2 протягом 18−24 ч, а потім отримана таким дорогою суспензія кліток подається у виробничих ферментери ємкістю 50−100 м3, в яких підтримується постійний режим аерації, необхідний тиск, контроль за всіма компонентами і параметрами середовища. Час ферментації 55−72 ч. біотехнологічний мутант мікроорганізм амінокислота Накопичення в культуральній рідині лізину починається після 25−30 ч вирощування промислової культури і до кінця ферментації досягає 40−50 г/л. Культуральну рідину відділяють від культури кліток продуцента фільтруванням і використовують для здобуття препаратів лізину. На основі промислової культури бактерій, що синтезують лізин, організовано виробництво декількох видів товарної продукції: рідкий концентрат лізину (ЖКЛ), сухий кормовий концентрат лізину (ККЛ), висококонцентровані кормові і високоочищені кристалічні препарати для харчової і медичної промисловості. Рідкий концентрат лізину отримують дорогою упарюванням культуральної рідини на вакуумній установці до концентрації сухої речовини 40%. Для запобігання деградації лізину в процесі нагрівання в культуральну рідину додають бісульфіт натрію і соляну кислоту до рН 4,5−5,0, внаслідок чого утворюється сіль — монохлоргідрат лізину.

Для здобуття сухого концентрату лізину сушать гарячим повітрям на розпилюючий сушарці при 90С до вологості препарату 4−8%. В цілях зниження гігроскопічності препарату в нього додають наповнювачів: м’ясо-кісткову муку, негашене вапно, бентоніт, пшеничні висівки. Найчастіше як наповнювач використовують висівки, які додають в ЖКЛ після упарювання. Отриману в результаті ретельного перемішування пасту висушують на вальцово-стрічковій сушарці і гранулюють. Гранульований препарат ККЛ негігроскопічний, містить 7−10% лізину.

Для здобуття очищеного висококонцентрованого препарату лізину культуральну рідину після фільтрування підкисляють соляною кислотою до рН 1,6−2,0. Утворився в результаті взаємодії з соляною кислотою розчин монохлоргідрату лізину направляють на колонки з катіонітом, де відбувається сорбція амінокислоти і відділення її від культуральної рідини. Потім проводять десорбцію амінокислоти шляхом елюювання 0,5−5% розчином аміаку. Елюат упарюють під вакуумом при 60? С до концентрації сухої речовини 30−50%, що після чого підкисляє соляною кислотою розчин монохлоргідрату висушують і використовують як кормовий концентрат.

Шляхом перекристалізації отриманої солі можна отримати препарати лізину з вмістом монохлоргідрату 97−98%. В процесі виробництва лізину окрім основного продукту вживання знаходять також побічні продукти і відходи. Так, після відділення культуральної рідини в осіданні залишаються клітки бактерій — продуцентів, фосфати і інші компоненти живильного середовища, які після висушування можуть бути використані як кормова білкова добавка.

Технологічні стоки і промивні води після виділення монохлоргідрату лізину, амінокислоти, що містять в розчиненому стані, інші коштовні компоненти культуральної рідини, залишковий лізин, об'єднують і отриману суміш упарюють, а потім висушують з наповнювачем до вологості 10%, в результаті отримують кормовий препарат з високим вмістом білків (до 40%) і незамінних амінокислот.

У ряді країн (Японія, США) для здобуття лізину застосовується хімико-ензиматичний метод, що дозволяє створити високоефективні технології, що поєднують достоїнства хімічного і мікробіологічного синтезу. Ці технології засновані на ферментативній конверсії в лізин, який отримують шляхом хімічних реакцій з циклогексану. В результаті хімічного синтезу утворюється рацемічна суміш Dі L-капролактаму. Ця суміш прямує в реактор з ферментом гідролазою — капролактаму, який каталізує перетворення L-капролактаму на L-лізин. D-ізомер капролактаму далі перетворюється на L-ізомер за допомогою специфічної рацемази.

При такій технології здобуття лізину його вміст в реакційній суміші після закінчення робочого циклу досягає понад 150 г/л. Продуцентами гідролази служать деякі штами дріжджів з пологів Cryptococcus, Candida, Trichosporon. Дріжджі вирощуються в лужному середовищі на оптимізованій для синтезу ферменту живильному середовищу, що містить активатори, — Mn2+, Mg2+, Zn2+. Для ферментативної реакції перетворення капролактаму в лізин може використовуватися клітинна суспензія дріжджових кліток з активним ферментом, клітинний екстракт (після руйнування і відділення кліток) або очищений фермент. Рацемазу, що каталізує перетворення D-капролактаму на L-ізомер, отримують з бактерій Achromobacter, Flavobacterium і ін. Процеси ізомеризації D-капролактаму в L-ізомер і перетворення L-капролактаму в лізин можна проводити одночасно. Для цього у водний розчин D, L-капролактаму вводиться необхідна кількість дріжджових і бактерійних кліток, задаються оптимальні режими температури, рН, аерації.

На виході з реактора утворюється переважно один продукт — L-лізин, який виділяють з суміші і далі виділяють і сушать. Окрім викладеної вище технології здобуття чистих препаратів лізину розробляються та інші, що поєднують в собі використання хімічного синтезу для здобуття попередників лізину і ензиматичне перетворення їх в лізин на кінцевій стадії виробництва, що дозволяє значно інтенсифікувати виробничий процес і понизити собівартість продукції.