Трансформація клітин табаку (Nicotiana tabacum) шляхом мікроін"єкцій

Міністерство освіти і науки України Пояснювальна записка до курсової роботи Трансформація клітин тютюну (Nicotiana tabacum) шляхом мікроін'єкцій

Реферат Пояснювальна записка до курсової роботи «Трансформація клітин тютюну (Nicotiana tabacum) шляхом мікроін'єкцій»: 27 с., 4 рисунки, 12 літературних джерел.

Мета роботи — дослідити механізм трансформації рослинних клітин шляхом мікроін'єкцій.

Об'єкт дослідження — використання мікроін'єкцій для трансформації рослинних клітин.

Предмет дослідження — клітини табаку.

Методи дослідження — пошук та аналіз літературних джерел.

Трансформація рослин має на меті поліпшення якості рослини і може використовуватись в медицині, хімічному виробництві та інших областях. Практично всі генно-інженерні розробки ставлять кінцевою метою рішення біотехнологічних питань.

Використання трансгенних рослин дозволяє налагодити масштабне та недороге виробництво таких речовин і тим самим зробити їх більш доступними для широкого вжитку.

Трансформація, рослинні клітини, мікроін'єкції, клітини табаку, Nicotiana tabacum.

Зміст Вступ

1. Загальні відомості

1.1 Механізми трансформації

1.1.1 Бактерії

1.1.1.1 Природна компетентність

1.1.1.2 Штучна компетентність

1.1.2 Дріжджі та інші гриби

1.1.3 Рослини

1.1.4 Тварини

2. Трансформація рослинних клітин шляхом мікроін'єкцій

2.1 Трансформація листових дисків тютюну

2.1.1 Методика отримання трансформованих пагонів

2.2 Підтримання і розмноження трансформованих пагонів

2.3 Розмноження пагонів тютюну за допомогою брунькових пазух Висновок Список використаної літератури

Вступ Перші трансгенні рослини (рослини тютюну з вбудованими генами з мікроорганізмів) були отримані в 1983 р. Перші успішні польові випробування трансгенних рослин (стійкі до вірусної інфекції рослини тютюну) були проведені в США вже в 1986 р.

Після проходження всіх необхідних тестів на токсичність, алергенність, мутагенність і т.д. перші трансгенні продукти з’явилися у продажу в США в 1994 р. Це були томати Flavr Savr з уповільненим дозріванням, створені фірмою «Calgen», а також гербіцид — стійка соя компанії «Monsanto». Вже через 1−2 роки біотехнологічні фірми поставили на ринок цілий ряд генетично змінених рослин: томатів, кукурудзи, картоплі, тютюну, сої, ріпаку, кабачків, редису, бавовнику.

В даний час отриманням і випробуванням генетично модифікованих рослин займаються сотні комерційних фірм у всьому світі з сукупним капіталом понад сто мільярдів доларів. У 1999 р. трансгенні рослини були висаджені на загальній площі близько 40 млн. га, що перевищує розміри такої країни, як Великобританія. У США генетично модифіковані рослини (GM Crops) складають зараз близько 50% посівів кукурудзи та сої і більше 30−40% посівів бавовнику. Це говорить про те, що генно-інженерна біотехнологія рослин вже стала важливою галуззю виробництва продовольства та інших корисних продуктів, яка залучає значні людські ресурси та фінансові потоки. У найближчі роки очікується подальше швидке збільшення площ, зайнятих трансгенними формами культурних рослин.

Перша хвиля трансгенних рослин, допущених для практичного застосування, містила додаткові гени стійкості (до хвороб, гербіцидів, шкідників, псування при зберіганні, стресів).

Нинішній етап розвитку генетичної інженерії рослин отримав назву «метаболічна інженерія». При цьому ставиться завдання не стільки поліпшити ті чи інші наявні якості рослини, як при традиційній селекції, скільки навчити рослини виробляти абсолютно нові з'єднання, використовувані в медицині, хімічному виробництві та інших областях. Цими сполуками можуть бути, наприклад, особливі жирні кислоти, корисні білки з високим вмістом незамінних амінокислот, модифіковані полісахариди, їстівні вакцини, антитіла, інтерферони та інші «лікарські» білки, нові полімери, що не засмічують навколишнє середовище і багато, багато іншого. Використання трансгенних рослин дозволяє налагодити масштабне та недороге виробництво таких речовин і тим самим зробити їх більш доступними для широкого вжитку.

Практично всі генно-інженерні розробки ставлять кінцевою метою рішення біотехнологічних питань. Сучасна біотехнологія — це наука про генно-інженерних та клітинних методах і технологіях створення та використання генетично трансформованих біологічних об'єктів для інтенсифікації виробництва або отримання нових видів продуктів різного призначення.

1. Загальні відомості

Генна інженерія — наука про генетичне конструювання, що направлене на створення нових форм біологічно активних молекул ДНК, генетично нових форм клітин, нових геномів і генетично нових організмів за допомогою штучних прийомів перенесення генів. У генної інженерії можна виділити два розділи:

1) клітинна інженерія;

2) генна інженерія, що базується на використанні векторної ДНК.

Трансформація — генетична модифікація клітини шляхом введення і подальшої експресії в ній чужорідного генетичного матеріалу (ДНК).

Зараз це загальна лабораторна процедура в молекулярнії біологіії. У 1944 році ефект був вперше продемонстрований Освальдом Авері, Коліном Маклеодом і Макліном Маккарті, які провели переніс гена до бактерії Streptococcus pneumoniae. Авері, Маклеод і Маккарті назвали такий переніс ДНК і, як наслідок, експресію перенесених генів трансформацією.

Фредерік Гріффіт перетворює непатогенних бактерій Pneumococcus в патогенні, змішуючи їх із вбитими патогенними бактеріями у 1928.

Освальд Авері, Колін Маклеод і Маклін Маккарті у 1944 виявляють, що перетворюючим фактором є ДНК і називають процес трансформацією.

1.1 Механізми трансформації

1.1.1 Бактерії

В бактеріях для опису процесів трансформації використовується термін компетентність — стан, коли бактерії мають здатність приймати ДНК із зовнішнього середовища. Існують дві форми компетентності, природна і штучна.

1.1.1.1 Природна компетентність Бактерії багатьох видів (можливо, більшості) природно здатні до прийняття ДНК. В стані компетентості бактерії виробляють особливий низькомолекулярний білок (фактор компетентності), що активує синтез автолізину, ендонуклеази і ряду факторів транскрипції. Автолізин частково руйнує клітинну стінку, що сприяє проникненню ДНК через неї, а також знижує чутливість бактерій до осмотичного шоку. В стані компетентності також знижується загальна інтенсивність метаболізму.

Еволюційна функція генів, що кодують вищезгадані ензими, спірна. Хоча більшість підручників і дослідників припускають, що клітини приймають ДНК, щоб придбати нові версії генів, простішим поясненням, яке відповідає більшості спостережень, є те, що клітини приймають ДНК переважно як джерело нуклеотидів, які можуть використовуватися безпосередньо або бути метаболізованими і використовуватися для інших цілей. Частіше за все бактерії, що природно піддаються трансформації, експресують свої гени компетентності тільки за специфічних умов, часто у відповідь на харчовий тиск. Як тільки ДНК потрапляє до цитоплазми клітини, вона часто розрізається клітинними нуклеазами, або завдяки процесу генетичної рекомбінації вона може бути вбудована в бактеріальний геном. Природна трансформація ефективна у випадку лінійної ДНК, але не кільцевої ДНК плазмід.

1.1.1.2 Штучна компетентність Штучна компетентність не кодується в генах клітин. Натомість, вона викликається лабораторними процедурами, в яких клітини пасивно робляться проникними для ДНК, використовуючи умови, які зазвичай не зустрічаються в природі. Ці процедури порівняно легкі і прості, і широко використовуються в молекулярній біології і генній інженерії бактерій. Штучно компетентні клітини стандартних бактеріальних штамів навіть виробляються комерційно, їх можна придбати замороженими і готовими для використання.

Охолодження клітин при наявності двовалентних катіонів, наприклад Ca2+ (у CaCl2), робить клітинні мембрани більш проникними до плазмідної ДНК. Бактерії культивуються з ДНК, а потім раптово нагріваються (до 42 °C протягом 30−60 секунд), що примушує ДНК до проникнення до клітини. Цей метод добре працює для кільцьової ДНК плазмід, але не для лінійних фрагментів хромосомної ДНК. Ефективність трансформації для високо компетентних клітин становить біля 108 випадків трансформації на мкг ДНК плазміди. Низько-компетентні клітини дають 104 / мкг або менше. Хороші непромислові підготовки повинні надати 105−106 трансформацій на мкг ДНК плазміди. Максимальна кількість компетентних клітин спостерігається в кінці фази логаритмічного росту і при подальшому суворому дотриманні низьких температур (4°C) середовища при приготуванні клітин.

Електропорація — інший спосіб створення отворів в клітинах, раптово шокуючи їх електричним струмом з напругою 100—200 В/мм. Плазмідна ДНК може проникнути до клітини через ці отвори. Природні механізми відновлення мембрани згодом латають ці отвори. Особливість цього методу полягає в тому, що середовище, в якому знаходяться клітини, повинні бути знесолені для запобігання короткого замикання.

Плазміди містять послідовності, що дозволяють їм реплікуватися у клітині незалежно від хромосоми.

В експериментах використовуються плазміди, які містять ген стійкості до антибіотиків і бактеріальні штами, що не мають стійкості до цього антибіотику (так звана селекція).

Тому, тільки трансформовані бактерії можуть вижити на селективному середовищі з цим антибіотиком.

Наприклад, плазміда, що містить ген, який кодує білок Я-лактамазу (тобто містить bla-ген), робить бактерій стійкими до ампіциліну. Бактерії потім вирощуються на середовищі з ампіциліном, вбиваючи бактерій, які не прийняли bla-ген.

Інший спосіб детекції клітин, що пройшли трансформіцію, — скрінінг, тобто використання генів, що роблять трансформовані бактерії візуально відмінними.

Наприклад, для цього використовується галактозидазний тест або експресія флюоресцентних білків, таких як GFP.

1.1.2 Дріжджі та інші гриби Відомо кілька методів трансформації дріжджів:

— Високоефективна трансформація (High Efficiency Transformation) згідно з протоколом, запропонованим Gietz та Woods.

— Дво-гібридний протокол (Two-hybrid System Protocol): Дво-гібридна система залучає використання двох різних плазмід в єдиній клітині дріжджів. Одна плазміда містить ген або послідовність ДНК, що повинні бути внесені до клітин, а інша плазміда містить бібліотеку генома або кДНК (cDNA).

— Швидкий протокол трансформації (Rapid Transformation Protocol) — див. посилання на статтю Gietz/Wood вище.

— Протокол замерзлих дріжджів (Frozen Yeast Protocol) дозволяє приготування замерзлі клітин дріжджів, компетентних для трансформації після розморожування.

— Генетична гармата (Gene Gun Transformation) — бомбардування клітин золотими або вольфрамовими частинками покритими ДНК.

— Протопластна трансформація (Protoplast Transformation) — грибні спори можуть бути перетворені на протопласти, який можуть прийнімати ДНК із розчину і трансформуватися.

1.1.3 Рослини Рис. 1 Рослина (S. chacoense) трансформовані використовуючи Agrobacterium tumefaciens. Трансформовані клітини формують калус на листових експлантах Доступні механізми перенесення ДНК до рослинних організмів включають:

Трансформація за допомогою Agrobacterium tumifaciens. Agrobacterium tumifaciens — це природня бактерія, яка паразитує на рослинах і містить спеціальну Ti — плазміду, в склад якої входить Т-ДНК, що здатна проникати в клітину рослини господаря і вбудовуватись в геном, а також vir-гени, відповідальні за процес переносу ДНК. Т-ДНК містить гени синтезу рідких амінокислот і вуглеводів (опінів), якими живиться бактерів, а також гени фітогормонів, що спричиняють пухлиноподібний ріст рослинних тканин. Рецептори на поверхні бактерії сприймають продукти розкладу рослинної клітинної стінки, в результаті чого активуються vir-гени, продукти яких сприяють процесу переносу Т-ДНК в рослинну клітину. Сама бактерія в рослинну клітину при цьому не потрапляє. Для генетичної трансформації рослинної клітини використовують бінарну веторну систему, яка складається з плазміди, що містить Т-ДНК, де гени синтезу опінів і пухлиноутворюючих фітогормонів замінені на цільовий ген, який має вбудуватись і хелперної плазміди, що містить vir-гени, що обслуговують процес переносу ДНК. Рослинна тканина (найчастіше, листя) нарізається на маленькі шматки, (біля 10×10 мм) і поміщається на 10 хвилин в середовище зAgrobacterium, який містить плазміду для перенесення. Здатність рослин утворювати на місці поранення меристематичну тканину, яка при певних умовах (фітогормональному складі середовища in vitro) здатна до регенерації і утворює вегетативні пагони з окремих трансформованих клітин. Далі рослини вирощуються на селективному середовищі.

Деякі види рослин можуть бути трансформовані методом in planta шляхом вакуумного «присмоктування» агробактерії до рослинної тканини. Це може бути як стабільна трансформація шляхом зараженням квіток (в такому разі трансформується ембріональна тканина), а потім висіванням насіння на селективне середовищі, або транзієнтна, шляхом вакуумної інфільтрації ДНК в листок.

Генетична гармата, або балістична трансформація: Маленькі золоті або вольфрамові частинки покриваються чужорідною ДНК і вистрілюються в молоді рослинні клітини або ембріони. Деякий генетичний матеріал залишиться в клітинах і трансформує їх. Цей метод також дозволяє трансформацію рослинних органел — пластид. Ефективність трансформації нижче, ніж при трансформації за допомогою Agrobacterium, але більшість рослин можуть бути трансформовані цим методом.

Електропорація: як і з бактеріями, отвори в клітинах рослин робляться, використовуючи електричний струм.

Вірусна трансформація: Генетичний матеріал упаковується у відповідному рослинному вірусі, а потім змінений вірус використовується для інфекції рослини. Геноми більшості рослинних вірусів складаються з одно-ланцюжкової РНК, який реплікується в цитоплазмі зараженої клітини. Так цей метод є трансфекцією, а не реальною трансформацією, тому що вставлені гени ніколи не досягають ядра клітини і не об'єднують з його геномом. Нащадки заражених рослин вільні від вірусу та від вставленого гена [2, 3].

1.1.4 Тварини

— Мікроін'єкція: використання дуже тонкої голки для ін'єкції ДНК безпосередньо в ядро ембріональних клітин.

— Вірусне перетворення: Аналогічно випадку з рослинами, генетичний матеріал упаковується у вірусі, який доставляє його до клітини. На відміну від рослин, у тварин цей метод часто приводить до дійсної трансформації.

2. Трансформація рослинних клітин шляхом мікроін'єкцій Техніка мікроін'єкцій, спочатку розроблена в 1970 р. для клітин тварин Грассманом і Дьякумакосом, в даний час стала методом для введення невеликих молекул, макромолекул (ДНК, РНК, білків), органел і вірусних частинок в різні тваринні клітини. Методика заснована на використанні скляних мікропіпеток з діаметром кінчика 0,5−10 мкм, за допомогою яких здійснюють пряме перенесення макромолекул в цитоплазму або в ядро реципієнтної клітини. Останню іммобілізують на твердій підкладці, штучно пов’язують з субстратом або закріплюють за допомогою піпетки з присоскою. Оскільки мікроін'єкція ДНК виявилася ефективним методом трансформації тваринних клітин, різні дослідники намагалися розробити подібні методи для трансформації клітин рослин. Однак з рослинними клітинами це довго не вдавалося. Успіх цих експериментів був обумовлений головним чином розробкою таких методичних підходів, які дозволяють локалізувати ядра і орієнтувати протопласти таким чином, щоб чужорідна ДНК могла бути введена безпосередньо в ядра протопластів без помітного зниження їх виживаності. Нові прийоми сприяли більш успішній внутрішньоядерній ін'єкції і, завдяки цьому, трансформації, що відтворюється.

Переваги та недоліки техніки мікроін'єкцій для трансформації рослинних клітин.

Переваги:

— Дуже високі частоти трансформації (15−60%), і, таким чином, метод може бути корисний у тих випадках, коли доступно тільки невелика кількість клітин, протопластів або органів;

— Метод дозволяє вводити макромолекули в цитоплазму або ядро;

— Середня кількість ін'єктованих макромолекул на клітину можна оцінити (приблизно 0,1−1,0 мкл) і контролювати;

— Метод допускає найбільшу гнучкість у виборі типу і розміру молекул або органел, використовуваних як донора (наприклад, ДНК, хромосоми, ядра, органели);

— Біологічний ефект ін'єктованого матеріалу можна оцінити в природному оточенні і спостерігати після ін'єкції;

— Методика не вимагає обов’язкового видалення клітинної стінки і, таким чином, може використовуватися у випадку тих видів рослин, які в даний час не вдається регенерувати з колоній, отриманих на основі протопластів. Це основна причина інтересу до мікроін'єкцій.

Цілком імовірно, що в майбутньому найбільшу увагу буде прикуто до мікроін'єкції клітин, здатних до ембріогенезу, клітин пилку, ембріогенних суспензійних культур або ізольованих сім'я-бруньок. Крім того, мішенню можуть стати клітини розвиваючихся зачатків, пагонів або ембріогенних тканин, ізольовані зародки і т.п.

Недоліки:

— метод відносно дорого налагодити і для його відтворення потрібно висококваліфікований і досвідчений персонал. Процес повільний — кваліфікований працівник здатний ін'єктувати 20−100 клітин за день;

— для ядерної трансформації чужорідної ДНК зазвичай введення необхідно здійснювати безпосередньо в ядро?? реципієнтної клітини. А введення мікропіпетки може чинити шкідливу дію на реціпіентні клітини;

Рис. 2 А. Метод, заснований на використанні полі-L-лізину.

Рис. 2 Б. Агарозний метод.

Рис. 2 В. Метод утримуючої піпетки.

— Для культивованих тварин клітин, які сплощені, прикріплюються до твердого субстрату і не мають клітинної стінки, положення ядра в цитоплазмі клітини не становить проблеми. Це справедливо і щодо яйцеклітин ссавців. При роботі з рослинними клітинами дуже важко проколоти клітинну стінку без забивання кінчика голки. Наявність клітинної стінки і форма рослинних клітин ускладнюють візуалізацію ядра. Якщо клітина іммобілізована в неправильній орієнтації, то практично неможливо потрапити в ядро, не пориваючи вакуоль, що викликає негайну загибель клітини. Іммобілізація сама по собі теж сприяє деякому пошкодженню протопластів;

— Для вирощування мікроін'єкційованих клітин потрібні спеціальні методи культивування.

Незважаючи на описані вище проблеми, в розробці методів мікроін'єкцій для рослинних клітин, особливо протопластів, досягнутий великий прогрес. У ранніх дослідженнях проводили ін'єкції в цитоплазму протопластів тютюну при 70%-вій виживаності. У цих експериментах використовували клітини двох-, триденного віку, отримані з протопластів, які сформували тонку клітинну стінку і здатні прикріплюватися до покривного скла, покритому полі-L-лізином (рис. 2 А). За мікроін'єкціями спостерігали, вводячи флуоресцентний барвник. Однак голка мікроін'єктора рідко потрапляла в ядро через те, що при використанні цього методу іммобілізації протопластів клітин важко локалізувати ядра. Полі-L-лізин часто має токсичну дію по відношенню до протопластів.

Пізніша розробка полягає в тому, щоб заплавляти протопласти в дуже тонкий шар легкоплавкої агарози. Завдяки даному методу іммобілізації, багато протопластів знаходяться у поверхні агарози і тільки частково оточені нею, так що їх неважко ін'єктувати (рис. 2 Б). При цьому локалізація ядра — непросте завдання. Перевага методу полягає в тому, що ін'єкційовані протопласти (клітини) вже знаходяться в культуральному середовищі, що забезпечує підтримку їх життєздатності. Розроблений ще один метод, який передбачає іммобілізацію протопластів за допомогою спеціально призначеної «утримуючої піпетки» (рис. 2 В). Протопласт можна втягнути або звільнити, прикладаючи позитивний чи негативний тиск до утримуючої піпетки, з'єднаної зі шприцом. Метод допускає маніпуляцію протопластами для оптимальної орієнтації ядра відносно ін'єкційної піпетки. Щоб легко візуалізувати ядро іммобілізованих протопластів (клітин) для ін'єкції чужорідної ДНК, зазвичай використовують інвертований мікроскоп, забезпечений диференціальною інтерференційною оптикою (Nomarski). Крім того, у багатьох випадках зручно фарбувати ядра ДНК — специфічними флуоресцентними барвниками, що не знижують життєздатність (Hoechest 33 258) і візуалізувати протопласти (клітини) за допомогою інвертованого мікроскопа.

Мікроін'єкції здійснюють під об'єктивом з 40-кратним збільшенням. Мікропіпетку спочатку заповнюють розчином для ін'єкцій, а потім направляють в іммобілізований протопласт (клітину), використовуючи мікроманіпулятор. Після введення мікропіпетки в ядро відповідний обсяг ін'єкційованого розчину переноситься в нього шляхом вдування або під тиском за допомогою шприца, з'єднаного одним кінцем з мікропіпеткою, а іншим — з системою регуляції тиску. Якщо клітини іммобілізовані на предметному склі або в агарозі, то ядра зазвичай інокулюють після того, як клітинам дали час відновитися, звичайно наприкінці першого дня після прикріплення або заплавлення. Дуже зручно імібілізувати клітини на спеціальній мікроскопічній платівці з нанесеною сіткою. Це дозволяє локалізувати окремі клітини в будь-який час до або після ін'єкції за допомогою відеозапису. Таким чином, можна стежити за їх розвитком і вжити відповідні дії, щоб забезпечити їх зростання в культурі.

Якщо використовуються утримуюючі піпетки, то протопласти слід виділяти з рідкої культури на стадії, коли вони компетентні для трансформації, проводити ін'єкції і потім культивувати в таких умовах, щоб їх можна було ідентифікувати. У більшості випадків інокульовані протопласти культивують у вигляді окремих клітин на фідерних культурах. Фідерна культура забезпечує життєдіяльність ін'єктованих клітин. Ін'єктувати можна лише невелику кількість клітин, а окремі клітини або малі їх кількості навіть в оптимальному поживному середовищі не діляться і незабаром гинуть. В якості клітин фідерної культури використовують клітини того ж виду, що і для ін'єкцій. Вони відокремлюються від ін'єктованих нейлонової марлею, яка допускає обмін хімічними речовинами між усіма клітинами. Таким чином, ін'єкційовані клітини залишаються життєздатними, розмножуються і незабаром досягають такої кількості, що можуть культивуватися без фідерних клітин. Ефективність висіву після ін'єкції зазвичай зменшується на 10−70%, але якщо використовується ефективна техніка мікрокультивування, це не становить великої проблеми, оскільки частоти трансформації дуже високі (в середньому 15−25%). Гібридизація по Саузерну показала, що трансформанти, які утворюються з мікроін'єкційованих клітин, містять перенесену ДНК, організовану так само, як при векторному перенесенні.

Незважаючи на описані вище проблеми в розробці методів мікроін'єкцій для рослинних клітин, особливо протопластів, досягнуто великого прогресу. У ранніх дослідженнях проводили ін'єкції в цитоплазму протопластів тютюну при 70% виживаності. У цих експериментах використовували клітини дво-, триденного віку, отримані з протопластів, які сформували тонку клітинну стінку і здатні прикріплюватися до покривного скла, покритому полі-б-лізином. За мікроін'єкціями спостерігали, вводячи флуоресцентний барвник. Однак голка мікроін'ектора рідко потрапляла в ядро через те, що при використанні цього методу іммобілізації протопластів/клітин важко локалізувати ядра. З тих пір повідомлялося, що полі-б-лізин часто має токсичну дію по відношенню до протопластів.

Пізніша розробка полягає в тому, щоб заплавляти протопласти в дуже тонкий шар легкоплавкої агарози в нейлонові кільці. Завдяки даному методу іммобілізації, багато протопластів знаходяться у поверхні агарози і тільки частково оточені нею, так що їх неважко ін'єктувати. При цьому локалізація ядра — непроста задача. Перевага методу полягає в тому, що протопласти (клітини), що ін'єкцюються, вже знаходяться в культуральному середовищі, що забезпечує підтримку їх життєздатності. Розроблений ще один метод, який передбачає іммобілізацію протопластів за допомогою спеціально призначеної «утримуючої піпетки». Протопласт можна втягнути або звільнити, прикладаючи позитивний чи негативний тиск до утримучої піпетки, з'єднаної зі шприцом. Метод допускає маніпуляцію протопластами для оптимальної орієнтації ядра відносно ін'єкційної піпетки. За допомогою даного методу іммобілізації Кроссвей з співавторами вперше показали можливість трансформації клітин рослин шляхом ін'єкції чужорідної ДНК.

Для підвищення ефективності трансформації до специфічної ДНК, що містить ген, за яким буде проводиться селекція, додається неспецифічна ДНК — носій. Зазвичай для цієї мети беруть ДНК з тимуса теляти або сперми лосося. Частина ДНК зв’язується з мембраною і не потрапляє в клітини. ДНК акцептують від 15 до 90% клітин. Через кілька діб після введення невелика частка клітин здатні експресувати чужорідні гени, але потім рівень експресії падає і більш-менш стабільної трансформації зазнає 10−3 — 10−5 клітин.

Для трансфекції використовується і ДЕАЕ — декстран, полімер, що адсорбує ДНК. Ефект входження в клітини і час експресії високі, але частота стабільної трансформації нижче, ніж при використанні преципітату кальцію. Частоту трансфекції збільшує гліцериновий шок (4 хвилини в 15% розчині гліцерину в НEPES — буфері).

В клітини можна вводити будь-який ген, якщо заздалегідь лігувати його з клонованим селективним маркером. Однак подальші дослідження показали, що лігування поза клітини не обов’язково. Клітини, що поглинають селективний ген, разом з ним поглинають і іншу ДНК, наявну в преципітаті кальцію. Таким чином, користуючись методом котрансформації, практично буде клонований сегмент ДНК можна ввести в культивовані клітини еукаріот, якщо включити цю ДНК разом з селективним маркером до складу суміші для утворення кальцієвого преципітату.

Для трансфекції можна використовувати хромосоми або фрагменти хромосом. Клітини-донори блокуються на стадії мітозу. Мітотичні хромосоми вивільняються під впливом осматичного шоку і гомогенізації. Їх очищають шляхом диференціального центрифугування. Хромосоми осаджують на поверхні клітин хлористим кальцієм, а через кілька годин обробляють реагентом, здатним перфорувати мембрани (наприклад, гліцерином). трансформація тютюн мікроін'єкція бруньковий Для обробки клітин-рецепієнта використовуються грубо очищені препарати хромосом, так як хромосоми при цьому руйнуються найменше. Кількість хромосом для обробки 1 клітини обмежена. Краще використовувати не більше 20 хромосом на 1 клітину-рецепієнта, так як при високих концентраціях хромосом в суспензії вони агглютинуються. Рецепієнтна клітина містить фрагменти донорних хромосом, які можуть вбудовуватися в геном, можуть репліціюватись самостійно. У введених фрагментах часто спостерігаються делеції.

Не всі клітини здатні до трансформації геномної ДНК з високою частотою. Людські фібробласти ефективно включають плазмідну ДНК і майже не включають геномну.

Мікроін'єкція ДНК в клітини ссавців стала можливою з появою приладу для виготовлення мікропіпеток діаметром 0,1−0,5 мікрона і мікроманіпулятора. Так, плазміди, що містять фрагмент вірусу герпесу з геномом тимідинкінази (ТК) і плазміду рВR322, були ін'єкційовані в ТК-клітини і було показано, що ТК-ген проник в ядра і нормально в них репліціювався. Метод введення ДНК за допомогою мікроін'єкцій був розроблений на початку 70-х років Андерсоном і Діакумакосом. В принципі, за наявності хорошого устаткування можна за 1 годину ін'єкціювати 500−1000 клітин, причому в кращих експериментах в 50% клітин спостерігається стабільна інтеграція та експресія ін'єктованих генів. Перевага описуваного методу полягає також у тому, що він дозволяє вводити будь-яку ДНК в будь-які клітини, і для збереження в клітинах введеного гена не потрібно ніякого селективного тиску.

Електропорація заснована на тому, що імпульси високої напруги оборотно збільшують проникність біомембран. У середовище для електропорації додають клітини і фрагменти ДНК, які необхідно ввести в клітини. Через середовище пропускають високовольтні імпульси (напруга 200−350 В), що призводять до утворення пор (електропробій) в цитоплазматичній мембрані, час існування і розмір яких достатні, щоб такі макромолекули, як ДНК, могли із зовнішнього середовища увійти в клітину в результаті дії осматичних сил. При цьому об'єм клітини збільшується.

Напруженість електричного поля і тривалість його дії при концентрації, що трансформує ДНК і реципієнтні клітини для кожної системи клітин підбирають експериментально, з тим щоб досягти високого відсотка поглинання ДНК виживання клітин. Показано, що в оптимальних умовах електропорації кількість трансформантів може досягати 80% клітин, що вижили.

Електропорація — фізичний, а не біохімічний метод, і це, мабуть, обумовлює його широке застосування. Численні дослідження продемонстрували, що електропорація може успішно використовуватися для введення молекул ДНК в різні типи клітин, такі як культивовані клітини тварин, найпростіші, дріжджі, бактерії і протопласти рослин. Електропоріюючий ефект високовольтного розряду на бішарову ліпідну мембрану, мабуть, залежить від радіуса її кривизни. Тому дрібні бактеріальні клітини ефективно поглинають ДНК при значно більшій напрузі (10 кВ/см і більше), ніж великі тварини і рослинні клітини, ефективно поглинають ДНК при напруженості поля 1−2 кВ/см.

Електропорація — найбільш простий, ефективний і відтворюваний метод введення молекул ДНК в клітини. Проте до недавнього часу цей метод використовувався в обмеженому числі лабораторій у зв’язку з відсутністю серійних приладів — електропораторів. Поява і вдосконалення таких приладів в найближчі роки призведе до широкого застосування даного підходу в генетичній інженерії самих різних типів клітин.

" Міні-клітини" отримують шляхом блокування донорних клітин мітозі кольцемідом. При тривалій обробці клітин кольцемідом в них навколо кожної хромосоми формується нова ядерна мембрана. Обробка цитохалазином В і центрифугування призводить до утворення міні-клітин, що представляють мікроядра, інкапсульовані в цитоплазматичну мембрану.

Отримані міні-клітини дуже чутливі до різного роду впливів, тому для злиття підбирають спеціальні м’які умови. Метод важкий, примхливий, ефективність низька — 10−6 — 10−7.

Ліпосоми — сферичні оболонки, які складаються з фосфоліпідів. Отримують їх шляхом різкого струшування суміші водного розчину і ліпідів, або обробляючи ультразвуком водні емульсії фосфоліпідів. Ліпосоми, що складаються з фосфатидилсерину і холестерину найбільш придатні для введення ДНК в клітини тварин і рослин. Системи перенесення за допомогою ліпосом низькотоксичні по відношенню до клітин [6, 7].

Метод біологічної балістики (біолістики) є одним з найбільш ефективних на сьогоднішній день методів трансформації рослин, особливо однодольних.

Суть методу полягає в тому, що на найдрібніші частинки вольфраму, діаметром 0,6−1,2 мкм, напилюється ДНК вектор, що містить необхідну для трансформування гену конструкцію. Вольфрамові частинки, що несуть ДНК, наносяться на целофанову підкладку і поміщаються всередину біолістіческой гармати. Калус або суспензія клітин наноситься в чашку Петрі з агаризоване середовище і поміщається під біолістичну гармату на відстані 10−15 см. У гарматі вакуумним насосом зменшується тиск до 0,1 атм. У момент скидання тиску вольфрамові частинки з величезною швидкістю викидаються з біолістичної гармати і, розриваючи клітинні стінки, входять в цитоплазму і ядро клітин.

Зазвичай клітини, що розташовуються безпосередньо по центру, гинуть за величезної кількості і тиску вольфрамових часток, тоді як в зоні 0,6−1 см від центру знаходяться найбільш вдало протрансформіровані клітини. Далі клітини обережно переносять на середовище для подальшого культивування та регенерації.

За допомогою біолістичної гармати були протрансформовані однодольні рослини, такі, як кукурудза, рис, пшениця, ячмінь. При цьому були отримані стабільні рослини — трансформанти. Крім успіхів в отриманні трансгенних однодольних, біолістична трансформація застосовується для прямого перенесення ДНК в ембріогенний пилок і подальшого швидкого отримання трансгенних дігаплоїдних рослин, які є важливим етапом у селекційній роботі. В даний час цим методом була проведена трансформація рослин тютюну і після регенерації гаплоїдних рослин отримані стабільні трансформанти.

2.1 Трансформація листових дисків тютюну У багатьох випадках при культивуванні рослинної тканини легше регенерувати пагони з експлантатів органів, ніж з отриманих на основі протопластів тканин або усталених (адаптованих) калусних культур. Онкогенна область т-ДНК у багатьох широко використовуваних неонкогенних векторах А. tumefaciens замінена на домінантний селективний маркерний ген неоміцинфосфотрансферази (NPT). Неоміцинфосфотрансфераза фосфорилює і, таким чином, інактивує антибіотик неоміцин/канаміцин, який в нормі токсичний для клітин вищих рослин. Трансформовані клітини в місці поранення, що експресують ген NPT, можна відбирати на середовищах, що містять антибіотик. В іншому випадку експланти, що інокулюються, можна помістити на середовище для регенерації пагонів. Пагони розвиваються безпосередньо з трансформованих клітин з невеликим додатковим утворенням калусу. Агробактерії видаляють шляхом обробки антибіотиками, які нетоксичні для рослинних клітин, такими, як цефотаксим.

Листові диски, отримані від рослин, що розмножуються in vitro або теплично, особливо зручні для експериментів з трансформації пасльонових, наприклад Nicotiana tabacum, Petunia hybrida і томатів, а також деяких інших сімейств. При культивуванні на відповідних середовищах листові диски швидко переходять до формування калусу в області зрізаних країв експлантів, особливо там, де вони знаходяться у контакті з середовищем. Якщо такі експланти помістити безпосередньо на середовище для регенерації пагонів, то протягом короткого проміжку часу (10−15 днів) поблизу зрізаних країв з’являються пагони разом із супутнім калусом. Середовища, які стимулюють регенерацію з листових дисків, зазвичай відрізняються високим відношенням цитокінінів до ауксину.

Описана нижче методика трансформації передбачає використання листових дисків Nicotiana tabacum. Важливо відзначити, що зрізи листових пластинок тютюну не містять бруньки або початки органів і, отже, більшість пагонів, що формуються у краю зрізу, походить з дедиференціювання клітин, чутливих до трансформації агробактерій. Багато інших типів експлантів містять меристеми або бруньки і можуть переважно продукувати зачатки пагонів з меристем камбію або інших глибоких шарів клітин експлантів, які нечутливі до Агробактерії.

2.1.1 Методика отримання трансформованих пагонів

1) Поміщають молоді, листя тютюну, що повністю розпустилися, в плоский стерильний посуд і заливають 10%-вим розчином миючого засобу Domestos. Обережно, щоб не пошкодити листя, видаляють всі бульбашки з поверхні листя шляхом обережного помішування стерильним шпателем і залишають на 15 хв.

2) Ретельно споліскують 4 рази на 400 мл стерильної води.

3) Працюючи на стерильній білій кахельній плитці, видаляють всі білі, пошкоджені при стерилізації ділянки листя і середню жилку, а потім розрізають лист на квадрати площею 0,5−1 см² за допомогою стерильного скальпеля. Ріжучий інструмент слід регулярно стерилізувати, занурюючи в спирт і обпікаючи в полум'ї пальника. Перед тим як розрізати експланти, інструменти необхідно охолодити. Готують достатню кількість матеріалу, щоб отримати 200 шматочків листа, однак, щоб уникнути висихання не слід нарізати відразу весь матеріал. Досить за один раз нарізати шматочки листа на 2−3 чашки. Поміщають по 10−12 шматочків листа на кожну з 20 чашок з середовищем Мурасіге-Скуга (MS) і герметизують чашки липкою стрічкою. Інкубують чашки протягом 2 діб при 24−26°С і низької освітленості (2000 люкс, фотоперіод 16 год).

4) Експеримент включає такі контролі:

Контролі (8 чашок). Поміщають по два неінокульованих контролі на кожну з нижчеперелічених середовищ:

MS; MS + цефотаксим (Cх); MS + канаміцин (Km); MS + Cx + Km;

5) Інокуляції (12 чашок). Поміщають шматочки листа в розведену 1:50 суспензію нічної культури відповідного штаму агробактерій, струшують надлишок рідини і поміщають їх на вихідну чашку з MS. Обмотують краю чашки липкою стрічкою і інкубують (24−26°С) при слабкій освітленості (2000;4000 люкс) ще 2−4 дні.

6) Після інкубації з агробактерій протягом 2 діб або при появі видимих?? бактеріальних колоній переносять інокулят шматочки листа на наступні середовища: 6 чашок S + Cx + Km; 6 чашок MS + CX.

7) Інкубують чашки при низькій освітленості (2000;4000 люкс) і температурі 24−26°С, періодично спостерігаючи за розвитком пагонів і калусу.

Наступний етап процедури трансформації - зрізання пагонів, що розвинулися в різних умовах обробки, та перенесення їх на селективне середовище для укорінення і виявлення трансформованих пагонів. Якщо експеримент з трансформації даного сорту проводиться вперше, то перш, ніж переносити пагони, важливо зробити деякі спостереження, що допомагають спланувати подальші експерименти за допомогою методу листових дисків.

Визначають ділянки утворення калусу і регенерації пагонів. Визначають кількість і розмір пагонів, що одержуються при кожній обробці, і оцінюють:

— Нормальну здатність листових дисків формувати калус і регенерувати пагони;

— Вплив антибіотика, переважної розвиток A. tumefaciens (в даному випадку, цефотаксима) на освіту калусу і регенерацію пагонів.

Підбирають концентрації селективного антибіотика (канаміцина) Нетрансформовані пагони іноді виживають в процесі селекції - це явище часто розглядають як «пробою». Однак коріння, як правило, більшою мірою чутливі до антибіотиків, і, отже, здатність пагонів вкорінюватися на селективної середовищі, що містить більш високі концентрації селективного агента являє собою вагомий доказ їх трансформованої природи.

Зрізають досить великі пагони, щоб з ними було легко маніпулювати (>0,5 см), і повністю видаляють калус.

Підрізають нижню частину пагона, поки не залишиться верхівкова брунька і два чи три листа з пазушними бруньками.

Поміщають зрізані пагони в агар із середовищами MS + Cx і MS + Cx + Km, та інкубують при 24−28°С і середньої освітленості (4000 люкс). Контрольний досвід на середовищі, що не містить селективного агента, необхідний, щоб упевнитися в тому, що вкорінення відбувається нормально.

У наступні 5−20 днів періодично спостерігають за експлантати пагонів, стежачи за появою ознак утворення коренів, хлорозу та формування нових листків. У більшості випадків тільки трансформовані пагони успішно вкорінюються на середовищі, що містить канаміцин.

2.2 Підтримання і розмноження трансформованих пагонів Для розмноження культивованих пагонів багатьох видів рослин відомі два основних способи. Пагони можна висадити в компост, вирощувати їх фотоавтотрофно і розмножувати шляхом отримання насіння. Це, зрозуміло, необхідно для вивчення нормальної експресії та успадкування перенесеного гена. Однак може виявитися, що після тривалої важкої роботи регенерувати всього кілька трансформованих пагонів. У цих випадках доцільніше розмножити цей надзвичайно цінний матеріал вегетативно. Така необхідність виникає тому, що багато гетеротрофних пагонів не приживаються в грунті як фотоавтотрофні рослини (культивовані пагони не здатні до інтенсивного фотосинтезу, а залежать від поживних речовин, що містяться в ростовому середовищі). До тих пір поки рослини не сформують воскову кутикулу, багато з них будуть в’янути і ніколи не відновляться. Крім того, в цих умовах рослини дуже сприйнятливі до ураження грибами. Можлива і атака шкідників або хвороботворних мікроорганізмів перш, ніж зав’яжуться насіння, так що розумно зберігати лінії рослин в культурі. Для прикладу описано розмноження пагонів тютюну.

2.3 Розмноження пагонів тютюну за допомогою брунькових пазух Видаляють укоріненні пагони з середовища і поміщають на стерильну білу кахельну плитку.

Розрізають стебло на кілька частин, кожна з яких містить пазушні бруньки. Видаляють листя, залишивши тільки короткі (2−3 мм) відрізки черешків.

Поміщають відрізок морфологічно нижнім кінцем в поживне середовище MS + Сх. Інкубують при низькому освітленні (2000;4000 люкс) і температурі 24−26°С, періодично спостерігаючи за розвитком пагонів з пазушних бруньок.

Розвинуті пазушні пагони зрізають. Вони можуть бути використані для розмноження, як описано вище.

При отриманні достатньої кількості пагонів їх укорінюють і переносять в грунт, вирощуючи в теплиці.

Висновок Початково розробка методів трансгеноза у рослин обгрунтовувалася необхідністю конструкції нових геномів, що забезпечують більш високу продуктивність, якість продукції і стійкість до несприятливих впливів. Виявилося можливим зливати не тільки протопласти рослин, що належать до різних видів і навіть до різних сімейств, але й проводити таку гібридизацію, в якій один з компонентів системи злиття — протопласт, а другий — ядро або сукупність генетичного матеріалу цитоплазми клітини. Великий інтерес представляє також можливість введення в рослинну клітину або популяцію рослинних клітин мікроорганізмів, що дозволило б вивчити ряд теоретичних питань і здешевити процес культивування на штучних поживних середовищах.

Одним з нескладних, але таким, що дає переконливий доказ трансгенності рослин і, тому, широко використовуваний, є метод гібридизації аналізованої ДНК з радіоактивною ДНК-зондом, присутність якої необхідно виявити в рослині.

Отже, при літературному огляді були знайдені найбільш використовувані та дієві методи трансформації рослинних клітин, а особливо клітин табаку, шляхом мікроін'єкцій.

Список використаної літератури

1. Божков А. И. Биотехнология. Фундаментальные и промышленные аспекты / Божков А. И. — Харьков: Изд-во Федорко М. Ю, 2008. — 363 с.

2. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: [Пер. с англ. / Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта]. — М.: Мир, 1991. — 408 с.

3. Глеба Ю. Ю. Слияние протопластов и генетическое конструирование высших растений / Ю. Ю. Глеба, К. М. Сытник. — К.: Наук. Думка, 1987. — 104с.

4. Глик Н. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение: учебн. [Пер. с англ. Пастернак Н. Е., Баскакова Ю.М.] / Глик Н., Бернард В.- М.: Мир, 2002. — 589 с.

5. Кучук Н. В. Генетическая инженерия высших растений. / Кучук Н.В.- К.: Наукова думка, 2002. — 150 с.

6. Нестабильность генома и эпигенетическое наследование эукариот / [Котлова Т.Ю., Волянский А. Ю., Кучма И. Ю. и др.]. — Харьков: Око, 2007. — 288 с.

7. Пирузян Э. С. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений / Пирузян Э. С. — М.: Наука, 1988. — 304 с.

8. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды / Сассон А. [Пер. с англ. / Под ред. В.Г. Дебабова]. — М.: Мир, 1987. — 411 с.

9. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / [В.С. Шевелуха, Е. А. Калашникова, С. В. Дегтярев и др.]; под ред. В. С. Шевелухи — М.: Высш. школа, 1998. — 416 с.

10. Сидоров В. А. Биотехнология растений. Клеточная селекция / Сидоров В. А. — К.: Наук. думка, 1990. — 280 с.

11. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия / Щелкунов С. Н. — Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. — 496 с.