ТСХ-скринінг «лікарських» отрут

лікарський ідентифікація препарат отруйний Процес ідентифікації невідомої лікарської сполуки, що стала причиною отруєння, складається з двох етапів: попереднього і підтверджуючого.

· Попередній етап дозволяє віднести отруту до визначеної групи хімічних сполук і заснований на використанні методу тонкошарової хроматографії (ТСХ) і системи «скринінгу», тобто системи добору, просівання.

Вибір методу тонкошарової хроматографії для пошуку «лікарської» отрути при неспрямованому дослідженні зумовлений багатофункціональністю методу:

• · Поділ препаратів і їхніх метаболітів.
• · Очищення від домішок.
• · Ідентифікація групи або препаратів індивідуальної речовини.
• · Кількісна оцінка аналізованого препарату.

Попередній етап складається з двох стадій:

• 1 стадія — застосовуються загальні системи розчинників, що дозволяють розділити аналізовані речовини на групи, що локалізуються у визначених хроматографічних зонах. У випадку позитивного результату при використанні загальних систем розчинників приступають до другої стадії.
• 2 стадія — застосовуються окремі системи розчинників, що дозволяють ефективно розділити сполуки, що входять в ту чи іншу хроматографічну зону.
• · Підтверджуючий етап — після проведення двох стадій попереднього етапу проводять підтверджуючі дослідження, що включають комплекс хімічних, фізико-хімічних методів, а також фармакологічні проби.

Негативний результат попереднього дослідження навіть на першій стадії свідчить про відсутність токсичних доз лікарських препаратів в екстрактах з біологічного матеріалу.

Попереднє хроматографічне дослідження ефективне за умови аналізу біологічного матеріалу, який не піддався процесам гнильного розкладання.

Умови ТСХ-скринінгу речовин кислого і слабоосновного характеру:

• · Загальна система розчинників — ацетон-хлороформ (1:9).
• · Хроматографічні пластини з закріпленим шаром силікагелю.
• · Довжина пробігу розчинників — 10 см.
• · Час насичення камери парами розчинника — 15−20 хв.

Хроматографічна пластина розділяється на 5 вертикальних смуг:

Стандарт По 1/25 «кислого» хлороформного екстракту — 1/10.

Як стандарт використовується циклобарбітал. Після розвитку хроматограми і висушування пластини проводять проялення барбітуратів, похідних саліцилової кислоти, піразолону, алкалоїдів — похідних пурину, індолу, похідних 1,4-бенздиазепіну.

Як проявники використовуються:

• · Для барбітуратів — послідовно 5% розчин HgSO4 і 0,1% розчин дифенілкарбазону в хлороформі (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями — смуги S і А),
• · Для похідних саліцилової кислоти, піразолону — 5% або 10% розчин FeCl3 (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями — смуга Б),
• · Для алкалоїдів, похідних 1,4-бенздиазепіну — реактив Драгендорфа по Муньє (спостерігаються оранжеві, оранжево-коричневі плями — смуга В).

Залежно від значень величин Rf сполуки на хроматограмі поділяють на три хроматографічні зони:

• 1. Зона з Rf — 0 -0,25 — похідні піразолону, алкалоїди.
• 2. Зона з Rf — 0,31- 0,41 — барбітурати, похідні 1,4-бенздиазепіну.
• 3. Зона з Rf — 0,41- 0,64 — похідні 1,4-бенздиазепіну.

Rs — являє собою відношення величини Rf аналізуючої речовини до величини Rf стандарту (циклобарбіталу). Вибір стандарту здійснюють так, щоб величина RS знаходилася в межах — 0,5−2. Величина Rs малочутлива до впливу випадкових відхилень в умовах експерименту і тому є більш точною оцінкою хроматографчної рухомості, ніж Rf.

Шар сорбенту з невиявленої смуги Г, розташований на одному рівні з забарвленою плямою на інших смугах з аналізованим екстрактом, знімають за допомогою скальпеля і елюють досліджувану речовину з:

• * хроматографічної зони 1 — метанолом,
• * хроматографічної зони 2 і 3 — ацетоном.

Елюат досліджують в окремих системах розчинників:

• * Похідні піразолону, алкалоїди (I зона) — ацетон-циклогексан (5:1), сорбент — основний окис алюмінію,
• * Барбітурати, похідні 1,4-бенздиаеепіну (2 зона) — хлороформ-бутанол-25% розчин аміаку (70:40:5), сорбент — силікагель КСК, забуферений розчином борної кислоти.
• * Похідні 1,4-бенздиазепіну (3 зона) — етилацетат-бензол-етанол-25% розчин аміаку (90:15:5:2,5), силікагель КСК.

Умови ТСХ-скринінгу речовин основного і слабоосновного характеру:

• * Загальна система розчинників — хлороформ-диоксан-ацетон-25% розчин аміаку (45:47,5:5:2,5);
• * Хроматографічні пластини з закріпленим шаром силікагелю,
• * Довжина пробігу розчинників — 10 см,
• * Час насичення камери парами розчинника — 15−20 хв.

Хроматограф пластина розділяється на 5 вертикальних смуг.

Стандарт По 1/25 «лужного» хлороформного екстракту — 1/10.

Як стандарт використовується етаперазин. Після розвитку хроматограми і висушування пластини проводять проявлення алкалоїдів; похідних фенотіазину, 1,4-бенздиазепіну, п-амінобензойної кислоти, піразолону.

Як проявники використовуються:

• · Для похідних фенотіазнну — 10% розчин Н2SO4 в етанолі (з'являються червоні і фіолетові плями — смуги S і А);
• · Для похідних фенотіазину, піразолону — 5% або 10% розчин FeCl3 (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плямисмуга Б);
• · Для алкалоїдів, похідних 1,4-бенздиазепіну, п-амінобензойної кислоти — реактив Драгендорфа по Муньє (спостерігаються оранжеві, оранжево-коричневі плями — смуга В).

Залежно від значень величин Rf сполуки на хроматограмі поділяють на три хроматoграфичні зони:

• 1. Зона з Rf — 0,12−0,36 — алкалоїди;
• 2. Зона з Rf — 0,50−0,58 — пурини, похідні піразолону, фенотіазину;
• 3. Зона з Rf — 0,63−0,83 — похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину, п-амінобензойної кислот;
• 4. Зона з Rf — 0,6−0,98 — алкалоїди, похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину.

Шар сорбенту з невиявленої смуги Г, розташований на одному рівні з забарвленою плямою на інших смугах з аналізованим екстрактом, знімають за допомогою скальпеля і елюють досліджувану речовину з:

• * хроматографічної зони 1 — сумішшю метанол-диетиламін (9:1);
• * хроматографічної зони 2 — 4 — сумішшю метанол-25% розчин аміаку (9:1).

Елюат досліджують в окремих системах розчинників:

• · Алкалоїди (1 зона) — хлороформ-диетиламін (9:1), сорбент — силікагель КСК;
• · Пурини, похідні піразолону, фенотіазину (2 зона) — хлороформ-етанол (5:1), сорбент — нейтральний окис алюмінію;
• · Похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину, п-амінобензойної кислот (3 зона) — хлороформ-етанол (20:1), сорбент — основний окис алюмінію;
• · Алкалоїди, похідні 1,4-бенздназепіну, фенотіазину (4 зона) — циклогексан-ацетон (5:1), сорбент — основний окис алюмінію.

Результати попереднього хроматографічного дослідження підтверджуються хімічними і фізико-хімічними методами аналізу.