Биологическая роль, структура і виділення мітохондрій з печінки крыс

Біологічна роль, структура і виділення мітохондрій з печінки крыс.

1.

Введение

.

1. Історія вопроса.

2. Перспективи исследований.

1. Біологічна роль митохондрий.

2. Ультраструктура митохондрий.

1. Загальні принципи организации.

2. Особливості будівлі мембрани митохондрий.

3. Опис загальних принципів різних методів виділення митохондрий.

1. Гомогенізація материала.

1. Механическая.

2. За підсумками кавітації газов.

3. Ультразвук.

2. Поділ субклеточных компонентов.

1. Центрифугирование.

2. Поділ в двухфазной системі, що містить два полимера.

3. Электрофорез.

4. Ферменти — маркери митохондрий.

4. Методики.

5.

Заключение

.

6.

Список литературы

.

Історія вопроса.

Кёлликер однією з перших описав характерним чином орієнтовані гранули в саркоплазме поперечно-полосатой м’язи. Йому належить як і честь першого виділення мітохондрій з клітинних структур. У 1888 року він виділив ці гранули з м’язи комах і показав, що вони мають мембраною і набухають у питній воді. Початком нової доби в цитологічному вивченні мітохондрій стала робота Бенсли і Хэрра, що робили спробу виділити мітохондрій з суспензії зруйнованих клітин печінки, застосувавши метод диференціального центрифугування. Через відсутність підхожого середовища для суспендирования недосконалість методу центрифугування Бенсли зірвалася отримати интактные мітохондрій, але саме новаторська робота Бенсли визначила злиття цитологічних досліджень мітохондрій з дослідженнями дыхания.

Перспективи исследований.

Нині основне завдання вивчення мітохондрій на молекулярному рівні зводиться до виділення ферментативних компонентів окисних циклів, визначення їхніх молекулярної структури та механізму дії, аналізу їхньої участі у полиферментных системах в мітохондріях і картированию їх локалізації на структурах мітохондрій. Те, що ферменти дихальної ланцюга перевищують 25% білка мітохондріальних мембран змушують розглядати ці ферменти як як функціональні, а й як структурні елементи митохондрии.

Біологічна роль митохондрий.

Протягом ста років, т. е. від часу перших робіт Кёлликера (1850), котрий спостерігав гранули в саркоплазме поперечнополосатых м’язів, велися кропіткі морфологічні дослідження, що поступово готували грунт усебічне вивчення природи мітохондрій. Однак у 1949 р. Кенеді та Ленинджер встановили, що у мітохондріях протікає цикл окисного фосфорилювання, тобто. що мітохондрій служать місцем генерування енергії. Відтоді починається нова ера до вивчення мітохондрій — ера, у якій блискучі відкриття йдуть одне одним. У стислі терміни було відкрито осмотическая, сократительная, регуляторна і генетична функції мітохондрій і знайдено багато тих молекулярних структур, які є первинним субстратом «цих функцій. Було показано також, що мітохондрій забезпечують інтеграцію численних процесів клітинного обміну. Ці дослідження — ще не, завершено, однак вони можуть служити прикладом плодотворності нового підходи до вивченню живого, того підходу, який відрізняє молекулярну биологию.

У розвитку молекулярної біології останнім часом намітився новий етап. До цього часу що це дослідження переважно, лише на рівні однорідних молекул білків і нуклеїнових кислот, дослідження, присвячені структурі, функції і биосинтезу. І ось дослідник не задовольняється цим правилом і переходить до вивчення специфічно організованих надмолекулярных комплексів, якими є клітинні органели. Деякі функції цих органел також може бути витлумачені лише на рівні індивідуальних молекул, наприклад молекул окремих ферментів. Але головне особливість клітинних органел — це інтеграція ферментативних процесів. Так, наявністю у складі мітохондрій різних білків, ліпідів, нуклеїнових кислот і вуглеводів, з'єднанню їх між собою і злочини упорядкованому розміщення у просторі як трехслойных мембран ці освіти набувають властивості, які зникають за її розчленування деякі молекули. Властивості ці: векторний характер дії мітохондріальних ферментів (на відміну скалярного, т. е. котрий залежить від напрямку, дії розчинних ферментів), спроможність до безпосередньому перетворенню енергії окислення в осмотичну і механічну енергію, спроможність до автономному синтезу білків тощо. буд. Кожна з цих властивостей визначається непростий сумою реакцій, катализируемых окремими ферментами, а зумовлено взаємодією точно орієнтованих ферментних і неферментных макромолекул. Звісно ж, що глибоке дослідження і пізнання природи клітинних органел можливий лише шляхом розчленовування їх у окремі молекули із наступною реконструкцией.

Ультраструктура митохондрии.

Загальні принципи организации.

Внутрішньо простір мітохондрії оточене двома безперервними системами мембран, кожна з яких є замкнутий мішок; ці мішки розташовані тож усю митохондрию можна уявити, як мішок всередині мішка. Просвіток внутрішнього мішка не повідомляється з реальним простором між двома мембранами. Зовнішня мембрана гладка, а внутрішня утворює численні впячивания, які у найпростішому випадку мають форму перегородок, але можуть приймати відвідувачів вкрай складні обриси. Палад назвав ці впячивания мітохондріальними кристами. Інший характерний компонент структури мітохондрії - це матрикс, який заповнює просвіток, оточений внутрішньої мембраною. Відомо, що він містить багато білка та деяка кількість ліпідів; очевидно, він має певної організацією і більш-менш жорсткої структурою. Нарешті, мітохондрії, фіксовані осмием часто перебувають у матриксе низка дрібних гранул. Кількість, діаметр і щільність цих внутримитохондриальных гранул змінюються залежно від стану обміну речовин, у тканях.

Особливості будівлі мембрани митохондрии.

Оскільки найбільше практичного значення представляють внутрішні мембрани мітохондрії, містять дихальні ансамблі, можна буде більш детально ознайомитися з ультраструктурой мітохондріальній мембрани. При докладний аналіз виявили, що мітохондріальні мембрани містять 35 -40% ліпідів, переважно фосфатидов, і 60 — 65% білка. Невеликі відмінності, що інколи спостерігаються обумовлене різними умовами отримання під час використання різних фізичних і хімічних способів руйнації структури митохондрии.

Мітохондрії печінки пацюки містять значні кількості фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, инозитфосфатидов, кардиолипина і фосфатидилсерина; зміст плазмалогена і сфингомиелина невелика, іноді вони зовсім відсутні. Характерне утримання і кількісний вміст ліпідів в мітохондріальній мембрані, мабуть обумовлені необхідністю підтримки термодинамічно стійкого подвійного шару ліпідів, утворить остов мембрани, який є опорою для дихальних ансамблів. Повидимому, велике значення має той факт, що всі ліпіди мітохондріальній мембрани экстрагируются сумішшю хлороформ — метанол. Це свідчить про наявність лише незначної кількості ковалентних перетинів поміж липидами і білковими елементами і навіть на повне відсутність; цього факту свідчить про високого рівня стабілізації ліпідів і білків мембранних структурах. Крейн показав, що цитохром з сполучається з фосфатидилэтаноламином, створюючи стійкий комплекс. Можливо, що став саме таку взаємодію липид — білок що з гидрофобными зв’язками і забезпечує таку стабілізацію мембранної структури. Криддл і працівники виділили мономерную форму, що вони назвали структурним білком мітохондріальній мембрани. При нейтральному рН структурний білок перебуває у полімерної форми і не розчинний у питній воді. Мономерная форма має молекулярний вагу близько 22 000, але тенденція до полімеризації порушує точність седиментационных і электрофоретических досліджень. Структурний білок здатний з'єднуватися з чистими цитохромами а, Т, і його освітою розчинних у питній воді комплексів в молярном відношенні 1:1, причому на умови цього взаємодії кожному за випадку різні. Передбачається, що у таких комплексах утворюються переважно гидрофобные зв’язку. Далі, виявилося, що структурний білок сполучається з фосфолипидами. Таким чином, структурний білок здатний до взаємодії з іншими основними молекулярними елементами мембрани — з переносниками електронів і з фосфолипидами. Схильність цитохромов, флавопротеидов і структурного білка існувати мономерной і полімерної формах свідчить про виражену тенденцію цих молекул до утворення дуже стійких макромолекулярных ансамблів, мають пластинчатую структуру.

Оскільки палестинцям не припиняти досліджень найбільше зацікавлення представляє цитохром з, слід приділити особливу увагу саме тому ферменту.

Цей цитохром відрізняється від інших тим, що він легко экстрагируется з мітохондрій в розчинній формі з допомогою кислот і нейтральних розчинів солей. Молекулярний вагу кристалічного ферменту 12 000, изоэлектрическая точка за вищого рН; в молекулу входить одна железопорфириновая група, представленої похідним протопорфирина і з'єднана (ковалентно) з двома цистеиновыми залишками пептидной ланцюга, у вигляді двох тиоэфирных связей.

При рН 7,0 атоми заліза у заключних положеннях 5 і шість, очевидно, скоординовано з залишками гистидина; при нейтральних значеннях рН цитохром з немає тенденції реагувати з киснем. Відомо, що третинна структура цитохрома з різко змінюється, як функція стану окислення — восстановления.

Цитохром з відновлюється тиолами, аскорбатом, хинолами, і відновленими цитохромами b і с1, а відновлений цитохром з окислюється феррицианидом, деякими барвниками і цитохромом а.

Було показано, що у водних розчинах цитохром з здатний до полімеризації; вдалося одержати його димер і очистити як і тример і тетрамер. Вторинна і третинна структура цитохрома з вивчається методом рентгеноструктурного аналізу. Цитохром із сполучається з липидами, в частковості з фосфатидилэтаноламином він утворює комплекс, під назвою липоцитохромом с.

Опис загальних принципів різних методів виділення митохондрий.

Мітохондрії і після виділення зберігають свій вигляд, не дивлячись те що, що мембрани їх ще кілька пошкоджуються і контури згладжуються. По суті, в час їх виділяють тим самим способом, яким користувався ще Варбург. Насамперед тканини гомогенизируют, використовуючи при цьому ізотонічний чи гіпертонічний розчин сахарози (сахароза сприяє схоронності мітохондрій, стабілізуючи митохондриальную мембрану). Потім методом диференціального центрифугування відокремлюють ядра і незруйновані клітини, а отриману надосадочную рідина знову центрифугируют за більш високих швидкостях. Мітохондрій осідають у своїй на дно, створюючи щільний буруватий осад. Промивши цей осад кілька разів можна було одержати досить чисту митохондриальную фракцію. Таким шляхом очищені фракції мітохондрій виділили із різних клітин тварини рослинного походження і навіть у деяких простейших.

У тих раніших дослідженнях мітохондрій, зазвичай, одержували доходи з печінки тварин, оскільки її клітини надто легко зруйнувати, а як і тому, що вона багата мітохондріальній фракцією. Потому, як було виявлено, що бактеріальна протеиназа руйнує клітину, не пошкоджуючи мітохондрій, розробили простий і швидкий метод отримання м’язових мітохондрій. Сахароза сприяє схоронності мітохондрій, стабілізуючи митохондриальную мембрану.

Гомогенізація матеріалу. Методи гомогенизации:

• Руйнування клітин (гомогенізатор Даунса 5−12 мл + щільно прилеглий маточка). Гіпотонічний шок + гомогенизатор.

• Метод заснований на кавітації газів (клітинна суспензія збагачена газоподібним азотом на 15−30 хвилин витримується при тиску до 65 атм., при швидкому зниженні тиску до атмосферного, внаслідок виділення азоту відбувається руйнація клітин. Органели залишаються интактными).

• Ультразвук. Склад середовища у якій руйнують клітини визначається застосовуваним методом гомогенізації. Для руйнації тканин використовують изоосмотический розчин сахарози з розрахунку 100 мл на 10 р сирого ваги тканини, у своїй не страшно якщо розчину сахарози буде значно більше, особливо в центрифугировании в роторе з більший обсяг. Гипотоническая середовище сприяє руйнації клітин, але, якщо обробка триває занадто довго, у своїй може статися руйнація клітинних органел. Інші параметри середовища важко узагальнити і кожен мембранний препарат вимагає індивідуального подхода.

Поділ субклеточных компонентов.

• Центрифугування. Заснований на розбіжностях за швидкістю седиментации (визначається вагою, розміром і формою частинок). Речовина, що використовується на приготування градієнта має бути легко розчинно у питній воді, фізіологічно без шкоди і хімічно інертно; його розчин може бути невязким, прозорим в видимої і УФ-областях спектра, має низька осмотическое тиск. Зазвичай поділ субклеточных компонентів проводять у градиенте щільності сахарози. Він задовольняє більшості зазначених вимог, але за високих концентраціях він дуже в’язань. Зазвичай поділ здійснюється за 3−4 години або протягом ночі при 80.000 буд чи вище в роторе з підвісними стаканчиками.

Обробка гомогената з печінки пацюки 10 мМ фосфатом калію збільшує швидкість седиментации мітохондрій, не впливаючи на осадження лизосом, що дозволяє очищати їх у градиенте щільності перколла.

• Поділ в двухфазной системі, що містить два полимера.

Полезным і швидким способом виділення мембран є поділ в водної двухфазной системі декстран — полиэтиленгликоль (ПЕГ), якщо відсутні необхідні ультрацентрифуги і ротори. Метод, продуктивність якої може бути легко підвищена, грунтується на використанні цілого ряду властивостей мембран, включаючи електричний заряд, щільність, масу чуток і гидрофобность. Різниця у тих властивості зумовлює різне розподіл компонентів суміші між верхньої та нижньої фазами і поверхнею розділу. По спорідненості до верхньої фазі компоненти тваринної клітини містяться у наступному порядку: эндоплазматический ретикулум / мітохондрій / лизосомы / апарат Гольджи / плазматические мембрани Успіх при застосуванні фазових систем залежить від адекватності вибору їх складу. Якість поділу залежить не тільки від конкретного полімеру (поки кількість їх обмежена — переважно використовують декстран і ПЕГ), а й з інших параметрів: молекулярної маси полімеру, концентрації солей, рН, хімічної модифікації полимера.

• Электрофорез.

С допомогою високовольтного електрофорезу у вільному потоці можна було одержати препарати субклеточных мембран і органел високого рівня чистоти. Що Підлягає поділу суміш компонентів подають тонкою цівкою в розмежує буфер, який рухається в електричному полі; мембрани, які мають різний електричний заряд переміщаються в що розділює осередку зі швидкістю, обумовленою їх зарядом, у своїй досягається 100%-ное дозвіл. Це м’який спосіб виділення мембран з великим препаративним виходом. Методику електрофорезу у вільному потоці вперше застосували виділення лизосом і мітохондрій з печінки крысы.

Таблиця 1. Ферменти — маркери мітохондрій |Фракція | |Маркерный фермент | |Мітохондрії |Внутрішня |Сукцинатдегидрагеназа, Цитохромкидаза, | | |мембрана |Ротеном-нечувствительная NADH — цитохром з | | | |- редуктаза | |Мітохондрії |Зовнішня |Моноаминооксидаза, Кинуренин-3-гидроксилаза| | |мембрана | |.

У таблиці 1 наведено ферментні маркери, до яких належать порівняно стабільні ферменти, активність що досить висока, і її зручно вимірювати. Зазвичай це виміру проводять якнайшвидше після виділення; зразок у своїй зберігають при 40С і заморожують. Відзначено, що такий фермент, як цитохром з — редуктаза може бути лабильным і втрачати активність в заморожених препаратах мембран з печінки. Для правильної оцінки розподілу фермента-маркера дуже серйозним є просторове розташування субстрат-связывающего сайта.

Методики.

Субфракционирование мембран і компонентів матриксу митохондрий.

Мітохондрії виділяють з багатьох джерел стандартними методами. Субфракционирование їх задля отримання внутрішніх та зовнішніх мембран і компонентів матриксу проводять після заморожування — відтаювання препарату і / чи обробки ультразвуком стандартного осаду мітохондрій, суспендированных серед, що містить 1.2 М сахарози і 2 мМ АТР (10 мг мембранного білка на 1 мл). У цьому відбувається руйнація мітохондрій, а після центрифугування в східчастому градиенте щільність сахарози зовнішні мембрани концентруються в смузі 0,45−1,12 М сахарози, внутрішні мембрани і компоненти матриксу збираються в осаді, під нижнім шаром з концентрацією сахарози 1,2 М, а проміжна везикулярная фракція — між двома попередніми, в смузі 1,12−1,20 М.

Маркерами внутрішніх мітохондріальних мембран служать ферменти — переносники електронів. Зовнішня мітохондріальна мембрана, яка за фрагментації утворює везикулы, подібні за щільністю і морфології з везикулами з плазматичної мембрани містить моноаминооксидазу. Описано також метод виділення зовнішніх мітохондріальних мембран з печінки крыс.

Метод противоточного розподілу митохондрий.

Препарати мітохондрій, виділені з печінки пацюки, досліджувалося Ерікссоном з допомогою методу противоточного розподілу. Мітохондрій, що входять до склад кожного з цих препаратів, можна розділити на дві основні популяції. Проте элетронно-микроскопическое дослідження не дозволило знайти ніяких відмінностей у структурі цих частиц.

Робоча методика виділення мітохондрій з печінки крыс.

• Середовище виділення: 0,25 М розчин сахарози, у якому 0,001 М ЭДТА, рН 7,4.

• Сахароза — 0,25 М раствор

• НС1 — 1 зв і 0,1 зв растворы.

• КІН — 1 зв і 0,1 зв растворы.

Усі реактиви готуються на бидистиллированной воде.

Ізольовану печінку пацюки занурююється у 30 мл крижаної середовища виділення. Після 2х — Зх кратного промивання тканину подрібнюють ножицями на чашці Петрі, що постала льоду. Кашку знову вміщують у склянку зі свіжої середовищем виділення, тож старанно промивають. Після осідання шматочків тканини на дно, рідина обережно зливають і промивання повторюють ще двічі. Тканина переносять в гомогенізатор, додають 40 мл середовища виділення, тож подрібнюють в протягом 30 — 40 секунд. До гомогенату додають 40 мл середовища виділення, перемішують повільно обертовим маточкою і розливають їх у 2 центрифужных склянки. Центрифугируют протягом десяти хвилин при 0−2 ОС, при 600 буд для видалення уламків клітин та ядерної фракции.

Супернатант обережно зливають і зберігають на льоду, залишки об'єднують їх і знову гомогенизируют 20 секунд в $ 20 мл середовища виділення. Гомогенат центрифугируют при 600 буд 10 хвилин, супернатант об'єднують з отриманим ранее.

Для осадження мітохондрії, об'єднаний супернатант центрифугируют в двох склянках при 14 000 g протягом десяти хвилин. Залишки об'єднують щодо одного склянці і старанно суспендируют з допомогою піпетки на 1 мл у невеликому обсязі середовища виділення (близько 0,5 мл). .Маленькими порціями, при обережне струшуванні додають 10 мл середовища виділення, тож в облогу беруть мітохондрії (14 000 g, 10 хвилин). Осад суспендируют в 0,25 М сахарозе, не що містить ЭДТА, і знову центрифугируют (14 000 g, 10 хвилин). Супернатант зливають, на отриманий осад мітохондрії обережно нашаровують 0,2 — 0,3 мл 0,25 М сахарози. Легким струшуванням змивають верхній вразливий шар осаду. Процедуру повторюють ще і отриманий щільний осад мітохондрії старанно суспендируют з допомогою піпетки в 0,4 — 0,5 мл 0,25 М сахарози. Густу суспензію мітохондрії переносять в пробірку і зберігають на льду.

Заключение

.

У цьому роботі запропоновані різні методики виділення мітохондрії з печінки пацюків, але використовуватися буде метод із застосуванням ультрацентрифугирования, як найприйнятніший і зрозумілу критеріям простоти праці та необхідного ступеня чистоти продукта.

Надалі планується фотометрическое дослідження этидиум бромида на активність цитохрома з з мітохондрії печінки пацюків. Ця робота представляє практичний інтерес, оскільки цитохром з є індуктором апоптозу — программированной загибелі клітин. Механізми цього процесу у час представляють великий інтерес (на лікування онкологічних заболеваний).

Список літератури 1. Альбертсон Пер-Оке «Поділ клітинних частинок і макромолекул », Москва,.

1974 2. Боуен Т. «Введення у ультрацентрифугирование », Москва, 1973 3. Під ред. Гілярова М.С. «Біологія. Великий енциклопедичний словник » ,.

Москва, 1998 4. Ленинджер А. «Митохонрия «Москва «Світ », 1966 5. Решетников В. М. та інших. «Техніка біохімічного дослідження субклеточных структур і біополімерів «т.2, Мінськ, 1977 6. Эванз У. Р. «Біологічні мембрани. Методи », Москва, 1990.