«Перфторан»: революційна комбінація

«Перфторан»: революційна комбінація

Андрей Артурович Недоспасов, д.х.н., Наталія Володимирівна Біда, м.н.с., Інститут молекулярної генетики РАН.

«Нет нічого більше практичного, чим хороша теорія» — фундаментальна наука неминуче знаходить вихід практику. На жаль, на рідній батьківщині ця аксіома дедалі більше виявляється теоремою, проблемою, або навіть просто ілюзією. Можливо, фундаментальні дослідження, достойні цієї роботи, дозволять відновити статус-кво і мінімізувати виміряти ціну виниклого дисбалансу.

Многие лікарських препаратів і лікування, відкриті набагато раніше «ери NO», в більшої або меншою мірою впливають на метаболізм оксидів азоту, але це часто залишається непоміченим, а лікувальні ефекти пояснюються іншими причинами. Яскравий приклад — клінічне застосування штучних кровозамінників з урахуванням перфторорганических сполук (ПФС), відомих у Росії під назвами «Блакитна кров» і «Перфторан» [1 -3 ].

Идея ПФС-кровезаменителей виникла наприкінці 1960;х років XX в. Оскільки рідкі ПФС чудово розчиняють кисень, емульсії їх міг би виконувати газотранспортну функцію еритроцитів крові. Дослідження активно проводили у Японії, СРСР та. У 80-ті роки, під час афганської війни, досвідчені партії радянських препаратів врятували чимало життів пораненим, приреченим на неминучу смерть втратою крові. Нині «Перфторан» допущений до клінічного застосуванню та вільно продають аптеках.

Со часом з’ясувалося, що «застосування «Перфторана», зокрема у «малих дозах, часто дає позитивні ефекти від, котрим зв’язку з його газотранспортної функцією що немає. Одночасно виявили ряд побічні ефекти, теж знаходили пояснення. Сьогодні з них стали зрозумілі завдяки уявленням про мицеллярном окисному нитрозировании *. Цей термін, запропонований нами запровадження радикала · NO в гетерогенної середовищі, передбачає, що у значною мірою реакції точаться суперечки з радикальному механізму: молекула NO реагує з вільним радикалом, утвореними з молекулы-мишени під впливом · NO2 — продукту окислення NO.

* Докладніше див.: Недоспасов А. А., Біда Н.В. Біогенні оксиди азоту // Природа. 2005. № 7. С.33−39.

Перфторуглеводороды (ПФУ) — екстремально гидрофобные речовини з великим коефіцієнтом розподілу Q для кисню і NO в сумішах із жовтою водою. Кисень розчиняється у яких (в гидрофобной фазі емульсії) набагато краще, ніж у воді чи плазмі крові, через що вони і в цьому використання у складі кровозамінників. Завдяки мицеллярному каталізу мікрокраплі емульсії у крові діють як губки обох газів, саме у ній відбувається тепер переважна більшість окислення NO.

В статті ми розглядали вплив гидрофобных фаз до процесів окислення NO (наприклад, при освіті холестеринових бляшок на стінці кровоносного судини). При порівнянні з емульсією ПФС-кровезаменителей помітні три істотних відмінності.

Во-первых, значно вищий значення Q. Оскільки прискорення реакції окислення NO під час введення оптимальних кількостей гидрофобной фази пропорційно QNO у присутності «Перфторана» окислюється набагато швидше [4, 5 ]. У цьому збільшуються швидкості нитрозирования та інших процесів, які залежать від мицеллярного каталізу, — усі вони протікають переважно у штучної гидрофобной фазі чи межі поділу фаз. Концентрація NO в водної фазі спочатку падає, що зумовлює активації ферментів NO-синтаз, постачальних NO.

Во-вторых, краплі емульсії не змочують стінки судин (перфторуглеводороды нічого не змочують з наявних у організмі поверхонь розділу фаз). Понад те, NO з холестеринових бляшок та інших «звичайних» гидрофобных фаз також частково перетворюється на краплі емульсії. Отже, повреждающее дію продуктів окислення NO на стінки судин зменшується.

В-третьих, лінійні розміри крапель емульсії в «Перфторане» менш 0.1 мкм (діаметр еритроцита ~20 мкм, а холестериновой бляшки значно більше); відповідно, ставлення поверхні обсягу оптимально для перебігу реакцій нитрозирования за українсько-словацьким кордоном розділу. Якщо навколишньому просторі присутні тиолы (RSH), крапля емульсії може діяти як мініатюрний реактор із виробництва тионитритов (RSNO). У нормі в плазмі крові досить висока концентрація відновленого глутатиона (трипептида, що містить залишок цистеина зі вільної HS-группой), нитрозоформа якого — прекрасний донор NO.

Таким чином, аналогія краплі перфторуглеводородной емульсії з эритроцитом виявилася набагато глибший, ніж вважали спочатку: обидва переносять і кисень, і вуглекислий газ, і NO/RSNO. Зрозуміло, що й малі дози кровозамінників типу «Перфторана», запроваджене кров’яний русло, мають ефектом, притаманним нітрогліцерину (основи динаміту і водночас популярного ліки), тобто. викликають релаксацію судин і відновлюють кровообіг.

В перших дослідах на пацюках було наочно продемонстровано вплив емульсій перфторуглеводородов на метаболізм NO: під час введення «Перфторана» спостерігалися передбачені коливання концентрацій нітриту і нітрату в плазмі, зміни частоти серцевих скорочень, звичайні при дії вазодилаторов типу нітрогліцерину. Ингибирование NO-синтаз знімало ці ефекти [6 ]. Через кілька років роботу повторили США [7 ].

Побочные ефекти застосування кровозамінників типу «Перфторан» у часто виявлялися не відразу, через чимало часу після переливання крові. Поверхнево-активні речовини, використовувані для стабілізації емульсій при створенні ПФУ-кровезаменителей, виводяться з організму набагато швидше, ніж самі ПФУ (характерні часи — добу і місяць відповідно). Якщо перші години після введення емульсія стає основним місцем окислення NO, то через добу процеси переміщаються головним чином природні липидные фази організму, в яких розчинилися ПФУ. Зрозуміло, що у організмі вони (як окремої фази чи розчинені в наявних гидрофобных фазах) впливатимуть як на параметри мицеллярного окислення NO через зростання QO2 і, особливо, QNO, а й у все наступні процеси, включаючи нітрація і нитрозирование ліпідів, білків і нуклеїнових кислот. Отже, «отруєння» під впливом хімічно інертних перфторуглеводородов, зокрема газоподібних, що розчиняються в липидах, можна пояснити втратою стійкості системи регуляції метаболізму оксидів азоту.

.

Рис. 1. Схема біосинтезу NO реалізувати основні метаболічні шляху оксидів азота.

Ускорение окислення NO киснем віддзеркалюється в рівновазі вищих оксидів азоту; у своїй їх стаціонарні концентрації змінюються. Якщо электрофильное нитрозилирование (освіту RSNO, мал.1) переважно протікає під впливом NO+ (N2O3, N2O4), а радикальні реакції (включаючи нітрація і окислювання білків і нуклеїнових кислот) — під впливом · NO2, то, при використанні штучних гидрофобных фаз як кровозамінників бажано змістити рівновагу в бік перших, у разі не збільшувати стаціонарні концентрації NO2.

Концентрации вищих оксидів азоту при окислюванні NO надзвичайно низькі, і виміряти їх звичайними методами вдасться. Ми простий і чутливий спосіб, заснований на визначенні нітрату продукти окислення. Нітрат відновлюється в нітрит сполуками ванадію, швидкість цього процесу вимірюють з допомогою реакції Грисса (за освітою барвника). Якщо з зразка видалити наявний спочатку (до відновлення нітрату) нітрит, весь зчинений барвник відбуватиметься з нітрату. Бо у результаті гідролізу N2O3 виходить лише нітрит.

N2O3 + H2O = 2HNO2, (1).

а при гідролізі N2O4 — эквимолярная суміш нітриту і нітрату.

N2O4 + H2O = HNO2 + HNO3, (2).

доля нітрату продукти буде мірою стаціонарних концентрацій обох оксидів. У цілому, в малополярных гидрофобных фазах стабілізація N2O3 при сольватации мінімальна, розпад на NO і NO2 посилюється, і NO2 має відбуватися:

NO2 + NO = N2O3. (3).

Анализ системи рівнянь для стаціонарних концентрацій оксидів азоту показав, що можливо зниження [NO2]ст незалежно змін [NO]ст і спільного пулу оксидів азоту [8 ]. Зокрема, вибірково прискорюючи нитрозилирование, ми знижуємо як [N2O3]ст, а й [NO2]ст, тобто. швидкості всіх радикальних реакцій з його участю. У цьому зв’язку пошук каталізаторів нитрозилирования/денитрозилирования стає важливою завданням біохімії.

.

Рис. 2. Гистограмма, відбиває внесок гетерогенності середовища проживання і каталізаторів денитрозирования до паливно-енергетичного балансу нитрит/нитрат при окислюванні NO. Зліва: в гетерогенної середовищі швидкість окислення NO вище, ніж у гомогенної. Зазвичай система рівноваг вищих оксидів азоту зсувається убік NO2 і N2O4, і нітрату в продуктах зростає. Triton X 100 — детергент (аналог мила), використаний щоб одержати ліпосом (за даними Liu et al., 1998). Праворуч: хоча у CF-эмульсиях швидкість окислення NO зростає сильніше, ніж у звичайних липидах, сольватация і швидкості гідролізу вищих оксидів азоту змінені. У присутності «Перфторана» частка нітрату продукти нижче, ніж у гомогенному водному розчині (ліва пара стовпчиків). Фосфат (PO4- 3), пиро- (P2O7−4) і триполіфосфат (P3O10−5) прискорюють гідроліз N2O3 в нітрит. Через війну стаціонарні концентрації NO2 і N2O4 зменшуються і вихід нітрату падає. Очевидно, що поліфосфат набагато активніше, ніж фосфат. Hepes — компонент буферного розчину.

Сравним вплив гетерогенності середовища проживання і сольватации на нитрит-нитратный баланс в продуктах окислення NO у присутності звичайних ліпідів й у «Перфторане» (мал.2). Очевидно, що у першому випадку при додаванні гидрофобной фази частка нітрату (а отже, що викликаються · NO2 радикальних реакцій!) зростає, у другому виявляється нижче, ніж у гомогенному водному розчині [9 ]. Почасти ефект пов’язані з каталітичним дією полиэфирного стабілізатора емульсії на реакцію нитрозирования. Його можна посилити з допомогою інших знайдених нами каталізаторів. На мал.2 як ілюстрацію показані каталітичні ефекти фосфату і триполіфосфату. При збільшенні швидкості гідролізу N2O3 (фактично — нитрозилирования води) зменшуються стаціонарні концентрації як N2O3, і NO2 через зсуву рівноваги у реакції (3).

Впрочем, й тут уникнути парадоксів і несподіванок. Перфторуглеводороды та його гетероаналоги (речовини, містять крім З і F інші атоми; наприклад, перфтороктилбромид — ПФБ), близькі по розчинюючої здібності щодо кисню, вважалися однаково інертними. Тому, за створенні кровозамінників вибір конкретних сполук був випадковою і визначався значною мірою тиском пара і доступністю в чистому вигляді. (У промисловості ПФУ та його гетероаналоги отримують для далекі від медицини цілей, зокрема на електротехніки.) Так, основу «Перфторана» становить суміш ізомерів перфтордекалина і перфтор-(4-циклогексил, N-метил)пиперидина (рис.3). У Японії США найпопулярніший перфтороктилбромид (C8F17Br, ПФБ; в кровезаменителях «Перфлюброн», «Оксиджент» та інших.).

.

Рис. 3. Формули перфторорганических сполук, які у виробництві кровезаменителей.

Интересно, що сьогодні перфтороктилбромид застосовується при штучної вентиляції легких. У легкі пацієнта (частіше у одне) вводять рідкий ПФБ (~1 л) і шланг з розпилювачем на шляху подання повітря, або кисню. Після закінчення процедури шланг видаляється, а ПФБ залишається у легенях поволі (недели-месяцы) виводиться з выдыхаемым повітрям, а частину його знаходять у крові.

Неоднократно зазначалося, що фізіологічні властивості і кровозамінників з урахуванням перфторуглеводородов, перфтороктилбромидов і чистих компонентів різні. Спричинено це залишалися незрозумілими. Справді, якби ефекти цих сполук зводилися тільки в транспорту кисню, вони було б однакові всіх ПФУ і ПФБ, оскільки значення коефіцієнта розподілу NO для перфтороктилбромидов і містять атома брому перфторсоединений, включаючи перфтордекалин (основний компонент «Перфторана»), також близькими. Отже, пояснити різні фізіологічні ефекти лише різною сольватацией NO зірвалася. У цьому поставили під постулат про інертності перфтороктилбромидов in vivo і почали шукати природні супернуклеофилы, здатні реагувати з нею за нормальної температури тіла [10].

Для перфторалкилгалогенидов були відомі реакції перфторалкилирования при каталіз низковалентными комплексами нікелю і кобальту. Найвідоміша форма існування кобальту in vivo — кобаламин (вітамін В12), що у відновленої формі служить кофактором низки ферментів (рис.4). Ми показали, що кобаламин активує ПФБ, певне, із заснуванням перфтороктильного радикала і Co (II), котрі можуть знову відновлюватися до Co (I). Отже, вітамін В12 в присутності відновлювачів ж виконує функцію каталізатора перфторалкилирования під дією ПФБ. Реакцію вдалося «візуалізувати» з допомогою флюоресцирующих мішеней. У тих умовах зв’язок C-F виявилася стійкою: ми не виявили перфторалкилирования під впливом перфтордекалина. Доля гидрофобных перфторалкильных радикалів in vivo залишаються невідомими. Мабуть, вони можуть ефективно реагувати з NO (природним инактиватором вільних радикалів), створюючи нові токсичні продукти.

.

Рис. 4. Схема каталізу кобаламином (вітаміном В12) реакцій перфторалкилирования під дією перфторалкилгалогенидов. In vivo кобаламин відновлюється до Со+1. Цей супернуклеофил здатний «вирвати» атом брому з молекули перфторалкилбромида (показано як CFBr). Утворений перфторалкильный радикал CF· входить у реакції з активированными подвійними зв’язками (показаний замещенный акриламід, Х — флюоресцирующая група), ароматичними сполуками та інших. Знову які утворилися радикали (2) стабілізуються різними шляхами, наводячи до стабільним CF-содержащим продуктам (3, 4).

Принципиальное відмінність ПФУ і ПФБ у ставленні до супернуклеофилам типу відновлених форм кобаламина дозволяє пояснити відмінність властивостей кровозамінників з їхньої основі: ПФБ в фізіологічних умовах не вважається хімічно інертним. Аналогічні пояснення можна й до численним отруєнням іншими перфторалкилгалогенидами (ПФГ): крім механізмів, що з NO-катастрофами, можуть брати участь у реакціях перфторалкилирования звичайних метаболітів. Зрозуміло, що низькі концентрації кобаламина в тканинах роблять їх малопомітними, але щонайменше неприємними, особливо в великих «періодах напіввиведення» (міра часу життя жінок у організмі) вищих гомологов. Ймовірно, що на посаді відновлювачів ПФГ, крім B12, можуть виступати й інші метаболіти. Оскільки сучасний рівень знань Демшевського не дозволяє оцінити віддалені наслідки і на рівень ризику, експерименти з допомогою перфторалкилгалогенидов на людях було б гранично обмежити.

Общее число пацієнтів, отримали великі дози перфтороктилбромидов по медичним показанням, і добровольців, учасників випробувань, невідомо, але явно п’ятизначне. Нижчі газоподібні перфторалкилгалогениды використовують як розчинники, зокрема при хімічної чистці одягу, як фреони (бромтрифторметан), соціальній та вогнегасниках і автоматичних протипожежних системах — від військову техніку до космічних кораблів багаторазового використання («Спейс Шаттл»). Описано безліч випадків отруєнь, зокрема зі смертельними наслідками, при вдиханні газоподібних перфторалкилгалогенидов. Вочевидь, як і тривалість впливу, і концентрації цих речовин (в частковості, в химчистках самообслуговування) можуть змінюватися в тому широких межах. Відомі приклади, коли серйозні проблеми з здоров’ям і смерть наставали часто через значний час після отруєння ПФГ.

Открытие перфторалкилирования при каталіз відомим вітаміном після 40 років робіт з використання ПФГ до медицини піднімає серйозні філософські питання. Кореляція між появою озонових дір і потраплянням фреонів у повітря — факт, встановлений під час фундаментальних наукових досліджень про. Реакція освіти перфторалкильных радикалів при опроміненні фреонів ультрафіолетом потрапила не лише у вузівські, а й у шкільні підручники. Зв’язок алкилирования ДНК і вільно-радикальних реакцій з мутаціями і на рак мусить уміти пояснити будь-який випускник середньої школи. Аналогія між озоном і високоактивними метаболітами, що у реакціях окислення (зокрема при біосинтезі NO), також видається досить очевидною. Проте тисячам добровольців і пацієнтів вводили й продовжують вводити великі дози ПФГ, що залишаються в організмі на місяці. Залишається загадкою, чому учасники, і в організаторів таких експериментів, попри всі ці знання, будь-коли поставало питання хімічної інертності ПФГ in vivo. Негативний у відповідь це запитання могла і мав бути отримано багато років тому, на початок масових експериментів на людях.

Сегодня гостра потреба до вивчення біохімії ПФГ і методів детоксикації цих сполук та його потенційних метаболітів очевидні, оскільки, попри попередження екологів, їх як і широко використав техніки і у побуті, і випадкові контакти з ними разі різноманітних аварій та форс-мажорних обставин траплятимуться і далі навіть за повному припинення використання перфтороктилбромидов до медицини. Ймовірно, що ефективним методом виведення труднолетучих ПФГ і продуктів їх перетворень виявиться короткочасне запровадження стабілізованих емульсій хімічно інертних перфторуглеводородов (типу «Перфторана») з наступним видаленням їх гемосорбцией разом із «экстрагированными» перфторалкилгалогенидами.

* * *.

В висновок хочемо навести приклади популярних препаратів, механізм дії яких пов’язані з регуляцією метаболізму оксидів азоту. Нагадаємо, що NO синтезується з аргініну під впливом NO-синтаз (NOS) і активує гуанилатциклазу (GC), що постачає Риму цикло-ГМФ, що й служить молекулярным поштовхом до розширенню судин (див. мал.5). Нітрогліцерин і амилнитрит як штучні донори NO при серцевої недостатності забезпечують розширення судин міокарда та запобігають розвиток інфаркту. Понад те, є підстави корисні навіть у ранніх стадіях після події інфаркту чи інсульту: крім поновлення кровотоку (завдяки активації гуанилатциклазы), утворений NO діє і як детоксикатор вільних радикалів, концентрація яких різко зростає після інфаркту чи інсульту, що стає причиною загибелі клітин серцевого м’яза чи мозку. Останніми роками як ефективної екстреної заходи пацієнта вміщують у атмосферу з дуже малим кількістю NO.

.

Рис. 5. Популярні фармацевтичні препарати, механізм дії яких пов’язані з регуляцією метаболізму оксидів азота.

Развитие септического шоку пов’язані з надмірної активністю NO-синтазы, індукованої які потрапили до кровообігу патогенами. Організм, намагаючись убезпечити себе від вторгнення чужорідних клітин, виробляє велику кількість NO їхнього знищення. Це спричиняє активації гуанилатциклазы, занадто сильному розширенню судин, як наслідок — до зниження тиску крові. Смерть настає від зниження ефективності кровообігу. Інгібітори NO-синтазы (наприклад, нитроаргинин) або введення до крові аргиназы (ферменту, руйнівної аргінін — попередник NO) може бути рятівними.

Уровень цикло-ГМФ підтримується балансом активностей гуанилатциклазы (синтез) і специфічної фосфодіестерази PDE5 (розпад). Ингибирование останньої забезпечує високу концентрацію цикло-ГМФ навіть за нестачі синтезу NO, активирующего гуанилатциклазу. Кофеїн — слабка й неспецифічний інгібітор фосфодиэстераз, расщепляющих цикло-ГМФ. Сильденафил («Віагра») — потужний і специфічний інгібітор фосфодіестерази PDE5 — виявився ефективним засобом при імпотенції (лихі язики запевняють, що є відкриття була вирішальною членам Нобелівського комітету). Той-таки то може бути досягнуть інгібуванням аргиназы.

«Перфторан» та інші штучні гидрофобные фази можуть виступати й як активатори, як і блокатори різних NO-зависимых процесів. Розчинність NO і O2 в емульсії перфторуглеводорода вище, ніж у плазмі крові, що спочатку забезпечує перетік NO з плазми в гидрофобную фазу емульсії, десь в результаті мицеллярного каталізу його окислення вище, ніж у оточуючої краплі емульсії плазмі. У цілому, концентрація NO у крові падає (показано червоною стрілкою), одночасно падає необоротне окислювання NO в нітрат під впливом гемоглобіну. Зниження концентрації розчиненої NO може активувати NOS. Продукти окислення NO переважно утворюються у емульсії, що саме там вище нитрозилирующая активність. Подальша доля продуктів окислення може регулюватися; можливий варіант, коли емульсія стає джерелом NO-доноров.

Скорости накопичення знань, появи нових технологій до початку третього тисячоліття стали буквально фантастичними. У істотною ступеня настільки бурхливий ріст має автокаталитический механізм: він забезпечується успіхами науки у попередні роки і регулюється швидкістю перетворення фундаментальних наукових відкриттів в нові технологіії, використовувані як «споживання», так подальшого розвитку досліджень. Для біології прикладами перших є поява методів діагностику і лікування невиліковних раніше захворювань чи виведення високопродуктивних сільськогосподарських культур. До других можна віднести все більш тонші методи аналізу (речовин, клітин та цілих організмів) чи синтезу складних «біологічних» молекул. У цілому нині, попередні успіхи у фундаментальні дослідження визначають нові досягнення економіки, і у самої науці.

Работа виконано з допомогою Російського фонду фундаментальних досліджень.

Проекты 02−04−49 530 і 03−04−6 492.

Список литературы

1. Шноль С. Э. Герої і лиходії російської науки. М., 1997.

2. Іваницький Г. Р. // Біофізика. 2001. V.46. P.5−33.

3. Squires J.E. // Science. 2002. V.295. P.1002−1005.

4. Gordin V.A., Nedospasov A.A. // FEBS Lett. 1998. V.424. P.239−242.

5. Рафикова О. В. // Тетяни. Мицеллярный каталіз окислення оксиду азоту в эмульсиях перфторуглеводородов та на цикл оксиду азоту в організмі ссавців. М., 2000.

6. Rafikova O., Sokolova E., Rafikov R., Nudler E. // Circulation. 2004. V.110. P.3573−3580.

7. Nedospasov A.A. // J. Biochem. Molecular. Toxicol. 2002. V.16. P.109−120.

8. Біда Н.В., Піменова (Сунцова) Т.П., Недоспасов А. А. // Проблеми та перспективи молекулярної генетики / Ред. Е. Д. Свердлов. М., 2004. Т.2. C.237−301.

9. Біда Н.В., Недоспасов А. А. // Біохімія. 2003. Т.68. С.1697−1704.

Для підготовки даної праці були використані матеріали із сайту internet.