Методика виділення і очищення фракції бластодерм зародків в'юна
Виділення бластодерм із зародків та їх дисоціацію до ізольованих клітин проводили по методиці, яка опублікована раніше. Ікру без оболонок попередньо відмивали декілька раз безкальцієвим розчином Стейнберга (5 ммоль буфер трис-Cl (рН=7,4), 120 ммоль NaCl, 1,3 ммоль KCl, 2 ммоль MgSO47H2O), потім поміщали в пробірки для центрифугування, у яких попередньо з допомогою нашаровування створювали… Читати ще >
Методика виділення і очищення фракції бластодерм зародків в'юна (реферат, курсова, диплом, контрольна)
Виділення бластодерм із зародків та їх дисоціацію до ізольованих клітин проводили по методиці, яка опублікована раніше. Ікру без оболонок попередньо відмивали декілька раз безкальцієвим розчином Стейнберга (5 ммоль буфер трис-Cl (рН=7,4), 120 ммоль NaCl, 1,3 ммоль KCl, 2 ммоль MgSO47H2O), потім поміщали в пробірки для центрифугування, у яких попередньо з допомогою нашаровування створювали градієнт сахарози: нижній шар має концентрацію 0,5 моль, верхній — 1 моль. У градієнті сахарози ікра занурюється на границі між шарами і в такому стані центрифугують 2−3 хв при 6500 g. Такої швидкості достатньо для того, щоб бластодерми відділилися від жовтка. Ізольовані бластодерми переміщуються в верхній шар сахарози, а жовток осаджується на дно пробірки. Ізоляти забирають із сахарози кінчиком піпетки і відмивають безкальцієвим розчином Стейнберга (у співвідношенні 1:10), залишають стояти 5 хв і потім повторюють процедуру 2 рази [18].
Виділення гетерогенної фракції ПМ із клітин зародків в’юна здійснювали при 0−4оС. Клітини, зібрані центрифугуванням при 100 g протягом 2 хв, суспендували в десятикратному об'ємі безкальцієвого розчину Стейнберга. Гомогенізацію проводили за допомогою гомогенізатора Поттера-Ельвенгейма в розчині, котрий містив 10 ммоль трис-Cl (рН=7,4), 5 ммоль MgCl2, 130 ммоль KCl (позначається дальше як ТМК) до руйнування не менше 95% клітин. До ТМК додавали сахарозу до кінцевої концентрації 40% (густина 1,18), після чого суміш центрифугували 20 хв при 10 000 g на центрифузі Jouan MR1812. Надосадову рідину, в якій знаходилася гетерогенна фракція ПМ, відбирали, а осад, котрий містив ядра та інші субклітинні компоненти з густиною вище 1,18 відкидали.
Слід зазначити, що на вихід ПМ суттєвий вплив здійснював спосіб зберігання клітин зародків в’юна і режим їх обробки. Оптимальним є збереження ізольованих клітин не більше 12−14 годин у безкальцієвому розчині Стейнберга в холодильнику. Після їх гомогенізації процес очищення мембран необхідно завершити в один день. Збереження клітин, гомогенату чи продуктів на проміжних етапах очищення суттєво понижує вихід мембран, який визначається по кількості білка. Очищенні ПМ можна зберігати при -20−70оС декілька місяців [12].