Еволюція генетичного коду. 
Теоретичні моделі

Еволюція генетичного коду. Теоретичні моделі

ЗМІСТ ПЕРЕЛІК СКОРОЧЕНЬ У ТЕКСТІ

ВСТУП РОЗДІЛ 1. ЛІТЕРАТУРНИЙ ОГЛЯД

1.1 Відкриття та характеристика генетичного коду

1.1.1 Поняття генетичного коду

1.1.2 Відкриття генетичного коду

1.1.3 Загальні властивості генетичного коду

1.2 Код, що еволюціонує

1.3 Практичне застосування генетичного коду РОЗДІЛ 2. МЕТОДИЧНА ЧАСТИНА

2.1 Об'єкт дослідження

2.2 Методика проведення експерименту РОЗДІЛ 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА ВИСНОВКИ СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ПЕРЕЛІК СКОРОЧЕНЬ У ТЕКСТІ

ДНК — дезоксирибонуклеїнова кислота РНК — рибонуклеїнова кислота т-РНК — транспортна рибонуклеїнова кислота

і-РНК — інформаційна рибонуклеїнова кислота м-РНК — матрична рибонуклеїнова кислота ВСТУП Актуальність теми полягає у тому, що все живе у своїй клітинній будові має одну спільну рису — ДНК. У наш час проводяться новітні розробки по вивченню генома людини та його розвитку. Зараз, за допомогою генної інженерії створюються нові види живого, вивчається вплив генів на відповідні захворювання, або на поведінку людей. Генетичний код зберігає «правильну» інформацію — завдяки цьому кожна клітина може жити, розмножуватися і формувати органи. Код передається від клітини до клітини, і він універсальний для усього сущого на Землі.

Проблема генетичного коду — це ключова проблема. У кінці 50-х — початку 60-х років вона приковувала до себе увагу, збуджувала активність умів, спонукала віру у велич і мудрість загадок науки. Сучасні уявлення про загальні властивості генетичного коду складаються з багатьох десятків і сотень експериментальних праць, математичних розрахунків, сміливих теоретичних пошуків, з узагальнень величезної кількості фактів, гіпотез і теорій. Тепер наші знання з окремих питань генетичного коду розширюються і поглиблюються, і ми можемо впевненіше говорити про ті або інші його властивості. У широкому сенсі генетичний код — це спосіб запису генетичної інформації в послідовностях нуклеїнових кислот (ДНК або РНК) про структуру поліпептидів (білків). У конкретному сенсі, генетичний код — це відповідність між триплетними кодонами матричної РНК (М-РНК) і амінокислотами кодованого білку, що задається кодовою таблицею.

Метою роботи є вивчення розвитку генетичного коду та його властивостей. При цьому вирішували наступні завдання :

Визначити основні властивості і характеристики генетичного коду.

Вивчити будову і склад геному.

Розглянути історію відкриття геному людини.

Довести механізм реплікації ДНК.

РОЗДІЛ 1. ЛІТЕРАТУРНИЙ ОГЛЯД

1.1 Відкриття та характеристика генетичного коду Найважливішим досягненням біології XX ст. стало з’ясування генетичного коду це встановлення відповідності між послідовністю нуклеотидів молекули ДНК та амінокислотами молекули білка. Нині генетичний код з’ясовано повністю.

Геном людини — це унікальна система запису інформації. Вона міститься переважно в молекулах ДНК, які знаходяться у хромосомах кожної клітини людини. Кількість хромосом — величина постійна. І якщо вона раптом міняється, патології неминучі. Генетичний код зберігає «правильну» інформацію — завдяки цьому кожна клітина може жити, розмножуватися і формувати органи. Схема проста — так розвивається будь-який організм від простого одноклітинного до більш складніших організмів. Система запису генетичного коду забезпечує її відтворення. Код передається від клітини до клітини, і він є універсальним для всього живого на Землі .

1.1.1 Поняття генетичного коду

Існує декілька понять генетичного коду:

— система зашифрованої спадкової інформації в молекулах нуклеїнових кислот, що реалізується у тварин, рослин, бактерій і вірусів у вигляді послідовності нуклеотидів;

— набір правил розташування нуклеотидів в молекулах нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), що надає всім живим організмам можливість кодування амінокислотної послідовності білків за допомогою послідовності нуклеотидів;

— система триплетів нуклеотидів, які визначають амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга.

У ДНК використовується чотири нуклеотиди — аденін (А), гуанін (Г), цитозин (Ц) і тімін (T), які в україномовній літературі також часто позначаються буквами А, Г, Ц і Т відповідно (Рис. 1.1.). Ці букви складають «алфавіт» генетичного коду. У РНК використовуються ті ж нуклеотиди, за винятком тіміну, який замінений схожим нуклеотидом, — урацилом, який позначається буквою У. У молекулах ДНК і РНК нуклеотиди складають ланцюжки і, таким чином, інформація закодована у вигляді послідовності генетичних «букв» .

Рис. 1.1. Будова ланцюгів РНК і ДНК Для синтезу білків в природі використовуються 20 різних амінокислот. Кожен білок є ланцюжком або декількома ланцюжками амінокислот у певній послідовності. Ця послідовність називається первинною структурою білку, що також у значній мірі визначає всю будову білку, а отже і його біологічні властивості. Набір амінокислот також є універсальним для переважної більшості живих організмів.

Експресія генів або реалізація генетичної інформації у живих клітинах (зокрема синтез білка, що кодується геном) здійснюється за допомогою двох основних матричних процесів: транскрипції (тобто синтезу м-РНК на матриці ДНК) і трансляції генетичного коду в амінокислотну послідовність (синтез поліпептидного ланцюжка на матриці м-РНК). Для кодування 20 амінокислот, а також стоп-сигналу, що означає кінець білкової послідовності, достатньо трьох послідовних нуклеотидів. Набір з трьох нуклеотидів називається кодоном.

Генетичний код, загальний для більшості про — і еукаріот.

1.1.2 Відкриття генетичного коду Генетичний код був розшифрований незабаром після відкриття двоспіральної структури ДНК. Було відомо, що відкрита молекула інформаційної, або матричною РНК (і-РНК, або м-РНК), несе інформацію, записану на ДНК. Біохіміки Маршалл Уоррен Ніренберг (Marshall W. Nirenberg) і Дж. Генріх Маттеї (J. Heinrich Matthaei) з Національного інституту охорони здоров’я в містечку Бетезда під Вашингтоном, округ Колумбія, поставили перші експерименти, які привели до розгадки генетичного коду.

Вони почали з того, що синтезували штучні молекули і-РНК, що складалися тільки з азотистої основи урацилу (який є аналогом тиміну, і утворює зв’язки тільки з аденіном, з молекули ДНК), що повторюється. Вони додавали ці і-РНК в тестові пробірки з сумішшю амінокислот, причому в кожній пробірці лише одна з амінокислот була помічена радіоактивною міткою. Дослідники виявили, що штучно синтезована ними і-РНК ініціювала утворення білку лише в одній пробірці, де знаходилася мічена амінокислота фенілаланін. Так вони встановили, що послідовність «У-У-У» на молекулі і-РНК (і, отже, еквівалентну їй послідовність «А-А-А» на молекулі ДНК) кодує білок, що складається тільки з амінокислоти фенілаланіну. Це було першим кроком до розшифровки генетичного коду. Сьогодні відомо, що три пари основ молекули ДНК (такий триплет дістав назву кодон) кодують одну амінокислоту у білку. Виконуючи експерименти, аналогічні описаному вище, генетики врешті-решт розшифрували увесь генетичний код, в якому кожному з 64 можливих кодонів відповідає певна амінокислота. У 1968 році Ніренберг, разом зі своїми колегами Робертом Холлі і Гобіндом Кораною отримав Нобелівську премію за розшифровку генетичного коду і встановлення механізму білкового синтезу.

Дослідження вчених відкрило принципово нові можливості в області вивчення спадкових захворювань та пошуку методів їх лікування.

1.1.3 Загальні властивості генетичного коду Універсальність генетичного коду.

Універсальність генетичного коду підтверджують численні факти, одержані у дослідах на бактеріях, амфібіях і ссавцях. Першу літеру генетичного коду вивчили Ніренберг і Маттеї на безклітинній системі білкового синтезу, виділеній з кишкової палички. Ця система широко застосовується і за нашого часу у різних молекулярно-генетичних дослідженнях. Аналогічні системи були створені з інших об'єктів. І завжди результати вивчення генетичного коду виявлялися ідентичними тим, що були одержані на кишковій паличці.

Подібні висновки зроблено і на системах білкового синтезу, компоненти яких узято з різних видів. Учені змогли. наприклад, ввести РНК вірусу тютюнової мозаїки у безклітинну систему кишкової палички і одержати білок, подібний до вірусного білка. У системі з ретикулоцитів кроля відбувається нормальний синтез гемоглобіну за допомогою РНК кишкової палички. Серед численних даних про мутаційні заміни амінокислот у різноманітних білках немає таких, які суперечили б припущенню про універсальність генетичного коду. Наприклад, дані про мутації гемоглобіну в людини добре узгоджуються з кодом, встановленим на кишковій паличці .

Оскільки проблема кодування зводиться до структури т-РНК, що, як і кожна РНК, синтезується певними цистронами, можна вважати, що в різних видів цистрони в кодовому відношенні розрізняються неістотно. Тоді механізм кодування слід визнати дуже давнім, не менш давнім, ніж сама клітина.

Усі живі істоти «розмовляють» однією мовою. Там, де вирує життя, відбувається реалізація генетичного коду із застосуванням одних і тих самих кодових слів. Реалізація генетичного коду — найважливіша, істотнісна ознака життя. Через неї можна визначити сутність життя на Землі. Ніренберг із співробітниками 1966 р. вивчив здатність одних і тих самих триплетів кодувати свою амінокислоту у бактерій, жаб і ссавців. Одні і ті ж кодони у різних видів поводять себе неоднаково кодон ГЦГ інтенсивно стимулює включення аланіну в бактерій і дуже слабко в амфібій; ААГ, навпаки, сильніше діє в амфібій і дуже слабко — у бактерій. Отже, код вірусів цілком схожий на код бактерій і ссавців. Виявлено лише відміни в «силі» окремих кодонів у різних організмів. Кодові властивості фракцій т-РНК і частота використання різних кодонів у різних видів неоднакові. Ніренберг висловив припущення, що генетичний код виник понад 0,6 * 109 років тому в організмів, близьких за складністю до сучасних бактерій, і відтоді твердо стабілізований .

У процесі виникнення життя раз обрані кодопи не переосмислюються — це було б згубним для організмів, бо зміна змісту навіть одного кодона призвела б до заміни амінокислот в усіх або майже всіх білках даного організму і ці білки були б неактивні.

Універсальність генетичного коду пояснює багато біологічних явищ. Наприклад, якби не було цієї властивості генетичного коду, віруси і фаги не могли б використовувати генетичну систему клітин хазяїна, паразитуючи у ній і застосовуючи для своїх потреб її білоксинтезуючий апарат. На універсальності генетичного коду базується і віддалена гібридизація — схрещування організмів різних видів.

Грунтуючись на універсальності генетичного коду, Крік спільно з Орджелем нещодавно висунули цікаву гіпотезу про походження життя на Землі. На їхню думку, життя на нашу планету могло бути занесене з космічного простору. Вся різноманітність життєвих флори на Землі виникла з одного джерела, що потрапило до нас із космосу. Спільністю походження і пояснюється універсальність генетичного коду.

Проте, на наш погляд, універсальність генетичного коду можна пояснити інакше: життя на Землі виникло самовільно, в одному сприятливому осередку, звідки поширилося по всій планеті. Це припущення усуває труднощі гіпотези Кріка і Орджеля, пов’язані з необхідністю пояснення того, як зародки життя збереглися в космічному просторі на шляху до Землі.

Колінеарність генетичного коду Така властивість генетичного коду означає, що лінійна послідовність амінокислот у білку і послідовність кодонів у нуклеїновій кислоті, яка визначає синтез даного білка, збігаються, тобто вони, як кажуть, колінеарні. Припущення про неколінеарність коду, висловлені 1962 р., спростовано прямими доказами. Яновський зі співробітниками (США) у 1964 р., порівнявши мутації в генах і спричинювані мутаціями заміни амінокислот у детермінованих цими генами білках, дійшли висновку про колінеарність коду .

Лінійний порядок зчитування тексту Як уже зазначалося, 1961 р. Крік, Барнет, Бреннер, Уотсон-Тобін показали, що код зчитується лінійно з певної точки. Зсув початку зчитування робить безглуздим увесь текст. За подальших років з’ясували механізм цього явища: в його основі лежить здатність рибосоми здійснювати трансляцію з певної ділянки і-РНК. Припускають, що в цих точках і-РНК розташовано кодони ініціації білкового синтезу. Синтез білка на і-РНК відбувається в лінійному порядку, починаючи з амінного кінця.

Генетичний код неперекривний При перекривному коді одна мутаційна заміна нуклеотиду тягла б за собою зміну кількох амінокислот у молекулах білків. Проте цього в природі не спостерігалося. Нині доведено, що генетичний код неперекривний. Кодове відношення дорівнює трьом. Кодове відношення — це кількість основ у молекулі і-РНК, ідо припадає в середньому на одну амінокислоту. Кодове число — кількість основ у кодоні. Перші дані про те, що кодове відношення дорівнює трьом або (менш імовірно) кратне трьом, були одержані в дослідах Кріка, Барнета, Бреннера і Уотсона-Тобіна 1961 р. У подальшому до такого висновку дійшли Т. Штехелін та його співробітники, котрі порівняли розміри і-РНК та білка гемоглобіну, що синтезується на ній, і одержали відношення, яке дорівнює трьом .

Кодове число дорівнює трьом — код триплетний Вперше ідею про триплетність коду висловив Гамов. Такого самого висновку дійшли Крік та його співробітники. У своїх міркуваннях вони виходили з побічних матеріалів і спиралися на той факт, що кодове відншення дорівнює трьом. Про триплетність коду свідчили також розрахунки та інші теоретичні дані. Ніренберг зі співробітниками 1964 р. двома незалежними способами довів триплетність генетичного коду. Вивчаючи залежність включення амінокислот від складу полірибонуклеотидів, учені встановили, що деякі амінокислоти кодуються триплетами. «Друга система Ніренберга», із застосуванням штучно синтезованих коротких і-РНК, що складаются з трьох нуклеотидів, дала можливість одержати прямі докази триплетності генетичного коду. Ці трійки нуклеотидів забезпечували включення відповідних амінокислот, і транспортування т-РНК до рибосом.

Виродженість і однозначність генетичного коду Серед еволюційних критеріїв, важливих для формування генетичного коду, однозначність і виродженість відігравали не останню роль. Однозначність свідчить про те, що кожний триплет кодує одну амінокислоту, а цистрон визначає один білок. Виродженість означає, що одна амінокислота може бути закодована кількома триплетами. У цьому разі генетичні повідомлення рідше втрачають смисл унаслідок мутацій .

Одній амінокислоті в таблиці генетичного коду відповідають 1, 2, 3, 4 або 6 кодонів. Кількість кодонів, що припадає на одну кислоту (коефіцієнт виродженості генетичного коду), така: глі — 4, ала — 4, вал — 4, ідей — 3, лей — 6, сер — 6, тре — 4, про — 4, асп — 2, глу — 2, ліз — 2, арг — 6, аспн — 2, глун — 2, цис —2, мет — 1, три— 1, фен — 2, тир — 2, гіс — 2.

Таблиця 1.1

Універсальний генетичний код

З двох або кількох триплетів, що ними кодуються амінокислоти, звичайно якийсь один триплет є найактивнішим, а інші беруть участь у кодуванні рідко або не за всіх умов.

Якщо наявні триплети-синоніми, які кодують одну амінокислоту, то код називається виродженим."Виродження" слід розглядати просто як термін, що відповідає певній властивості коду.

Виродженість коду досить висока і має невипадковий характер. Усі чи майже всі можливі триплети змістовні. У більшості випадків триплетам, які кодують одну й ту саму кислоту, властиві дві спільні основи.

Учені відзначили цікаву особливість: чим частіше у білках трапляється амінокислота, тим вищий у неї коефіцієнт виродженості, який наче охороняє дану амінокислоту від мутаційної заміни.

Нещодавно Ф. Сангер (Англія) та співробітники його лабораторії показали, що послідовність з 57 нуклеотидів однозначно відповідає амінокислотній послідовності білка оболонки фага р-17 у ділянці від 82-го до 100-го амінокислотного залишка. Тут справді реалізується множинність кодонів для ряду амінокислот, тобто виродженість коду виявилась реально існуючою при кодуванні білка природною і-РНК вірусу. І самий код, розшифрований в основному на штучних системах, цілком підтвердився на живій системі.

Правило виродженості коду пояснюється гіпотезою Кріка про неоднозначне пізнавання нуклеотиду в третьому положенні кодона і множинністю фракцій т-РНК.

Коли, наприклад, у кодоні ЦГА, який визначає аргінін, станеться заміна цитозину на аденін, то виродженість коду приведе до того, що у білковій молекулі, синтезованій на і-РНК з таким зміненим триплетом, не відбудеться жодних змін, оскільки АГА також визначає аргінін.

1.2 Код, що еволюціонує

Білкові молекули, крім активних ділянок, містять чималі ділянки, неістотні для функціонування білка. Це створює величезні еволюційні можливості: у неактивних ділянках цистронів може відбуватися інтенсивний перебір мутацій і рекомбінацій, що забезпечує безперервність біологічної функції білка. Створюється величезна різноманітність мутантів у кожному цистроні.

У 16 організмів — представників самих різних галузей еволюційного дерева — генетичний код відрізняється від канонічного. Так, багато видів зелених водоростей Acetabularia транслюють стандартні стоп-кодони УАГ і УАА в амінокислоту гліцин, а гриб Candida інтерпретує РНК-кодон ГУГ не як лейцин, а як серин. Існування таких варіацій свідчить про можливу еволюцію генетичного коду. Представники майже всіх трьох доменів живих організмів іноді прочитують стандартний стоп-кодон УГA як 21-у амінокислоту селеноцистеїн, що не відноситься до 20 стандартних. Селеноцистеїн утворюється при хімічній модифікації серину на стадії, коли останній ще не відокремився від т-РНК у складі рибосоми. Аналогічно у представників двох доменів (архебактерій і бактерій) стоп-кодон УAГ прочитується як 22-а амінокислота пірролізин.

Можливо, у розпорядженні ранніх організмів було не 20 амінокислот, а менше. Більш складні амінокислоти з’явилися пізніше, у результаті біохімічних модифікацій більш простих. Так, у деяких бактерій амінокислота глутамін утворюється з її біохімічного родича глутаміновоїкислоти, коли та ще перебуває в комплексі із т-РНК. Більш складні варіанти амінокислот, що утворилися з обмеженого набору попередників, окупували їх т-РНК разом з відповідними кодонами, точно так само, як деякі кодони окупуються канонічними амінокислотами в сучасних організмів, що використають альтернативні коди [6,7].

У багатьох випадках, як уже зазначалося, схожі білки в різних видів різняться невеликою кількістю амінокислот. Часто такі заміни не пов’язані з якоюсь певною зміною функцій. Звідси можна сказати, що склад ДНК, а отже, і відповідних білків, крім змін, контрольованих добором, зазнає випадкового «дрейфу», який залежить лише від набору мутагенів і не дає біологічних переваг. Іншими словами, перебір первинної структури цистронів у багатьохвипадках не призводить до еволюційних змін. Частина варіантів генетичних повідомлень майже рівнозначна іншим повідомленням. Це теж своєрідне виродження, проте на рівні не кодонів, а генетичних фраз.

Загальна спрямованість еволюційного процесу свідчить про те, що еволюція генних систем ішла не стільки шляхом утворення цілком нових генних структур, скільки шляхом ускладнення взаємодій між генами як в окремій клітині, так і в організмі [6,7] .

Механізм синтезу білка зазнав тривалої еволюції. Мабуть, первинні білки утворювалися випадково, поява РНК була обумовлена виникненням ферментів, пов’язаних з її синтезом, подвоєнням і взаємозв'язком з білком. Розвиток цього взаємозв'язку привів до формування коду, спочатку примітивного, потім ширшого і виразнішого. Появу дволанцюжкової ДНК як основної структури, відповідальної за «пам'ять» і розмноження, слід вважати подальшим удосконаленням механізму біосинтезу білка, котре поліпшило чіткість діяльності системи та її захищеність. Це було необхідно для того, щоб здійснити синтез молекул ферментів, більших, ніж молекули ферментів, які синтезувалися без ДНК. Про еволюцію генетичного коду свідчить також «принцип зв’язаності серій», сформульований 1963 р. В. О. Ратнером. За цим принципом кожен член серії кодонів може бути одержаний з якогось іншого члена заміною лише однієї літери. Мабуть, шляхом однолітерних замін і йшла еволюція кодонів .

Ф. Крік припускає, що на початку еволюції білки найпростіших організмів містили не всі амінокислоти, а лише певну їх частину. Код був більшою мірою вироджений: одній і тій самій амінокислоті відповідала більша кількість кодонів. Нові амінокислоти, що утворювалися в процесі еволюції, могли бути похідними від уже Існуючих і займати частину кодонів, відповідних тій амінокислоті, на якувони були схожі за фізико-хімічними властивостями (наприклад, фенілаланін і тирозин). Саме цим можна пояснити той факт, що гідрофобні амінокислоти групуються у певних частинах таблиці і кодуються подібними кодонами.

Джакс розрізняє чотири стадії в еволюції коду. На ранніх стадіях у білковому синтезі брали участь 15 амінокислот:цис, ала, вал, асп, глі, ілей, сер, аспн, про, глун, глу, тре, фен, ліз, тир. Ці амінокислоти трапляються в найдавніших білках мікроорганізмів (вони виникли тоді, коли в атмосфері ще не було кисню). Вони не містять арг, гіст, лей, мет, три. Мабуть, останні п’ять амінокислот були залучені у білоксинтезуючу систему на пізніших стадіях еволюції генетичного коду. Припускають, що еволюція генетичного коду відбувається через зміни ДНК — здебільшого внаслідок дуплікацій, делецій і мутацій у цистронах, які контролюють синтез різних видів т-РНК. Мутація, що виникла у такий спосіб в антикодоні т-РНК або на ділянці аміноацил-т-РНК-синтетази, примушує т-РНК зв’язуватися з іншим кодоном чи утворювати комплекс з іншою лінокислотою. Змінена т-РНК може також стати нефункціональною і потім зникнути з клітини. Роль змін і-РНКеволюції коду пасивна, бо її трансляція залежить відРНК.

Можна сказати, що гіпотези про еволюцію механізму синтезу білка поки щев теоретичній розробці.

1.3 Практичне застосування генетичного коду Вищий пріоритет у молекулярній біології - пошук реальних генів у тих накопичених даних, які отримані в результаті секвенування генома. Однак поки біологи не можуть до кінця розібратися й з тими генами, які вже ідентифіковані. З огляду на способи, якими транслюються генні мутації, ми можемо використати все, що відомо про генетичний код, для розпізнавання найрізноманітніших генів і для встановлення функцій кодованих ними білків. Ми навіть можемо знайти ключ до розгадки просторового впакування білкових молекул, які диктуються послідовністю амінокислот. Для цього потрібно проаналізувати властивості кодонів, що забезпечують мінімізацію ціни помилок, і зрозуміти, як можуть заступники вплинути на розмір, заряд і гідрофобність амінокислот.

Повністю вивчивши організми з нестандартним генетичним кодом, можна спробувати «замаскувати» гени для проведення з ними різних експериментів.Оскільки генетичний код у першому наближенні універсальний, вважається, що будь-який ген людини (наприклад, один з онкогенів) можна вбудовувати в геном більш простих організмів (таких як E. сoli) без шкоди для його функціонування. Але іноді абудований ген у новому організмі не експресується взагалі або експресується менш ефективно, або синтезований білок небагато відрізняється від того, котрий утвориться в організмі людини. Така розбіжність може виникнути тому, що різні організми віддають неоднакові переваги синонімічним кодонам (використовують їх з різною частотою). Так, із шести кодонів, що відповідають амінокислоті аргініну, у людини найчастіше використовуються AГA і AГГ. E. Сoli ж використовує кодон AГA дуже рідко й при його трансляції часто робить помилки. З огляду на ці переваги, можна конструювати такі версії генів людини, щоб їх можна було без наслідків вбудовувати в геном різних організмів.

Розробляються програми, які могли б стати інструментом для конструювання генів, для пошуку нових генів. Досліджується, як сформувався сам генетичний код: як почалася взаємодія між РНК і амінокислотами, яким чином із цього комплексу виникла система формального кодування, як розширювався амінокислотний алфавіт на ранніх етапах еволюції. Розшифровка генетичного коду — тільки перший крок на шляху до вирішення цих і інших проблем [6,7].

РОЗДІЛ 2. МЕТОДИЧНА ЧАСТИНА

2.1 Об'єкт дослідження генетичний код ланцюг клітина Об'єктом дослідження виступає вирощування культури клітин E. Coli на протязі багатьох поколінь в середовищі, що містить як джерело азоту хлористий амоній (NH4С1), в якому звичайний поширений ізотоп [14N] був замінений на «важкий» ізотоп [15N] (отже їх ДНК містило тільки [15N]). Генетичний код Е. Соli є високоорганізованою системою відповідностей між кодонами та амінокислотами, що підтримується складними молекулярними механізмами .

ДНК була відкрита Іоганном Фрідріхом Мішером у 1869 році. Спочатку нова речовина отримала назву нуклеїн, а пізніше, коли Мішер визначив, що ця речовина володіє кислотними властивостями, речовина отримала назву нуклеїнова кислота. Біологічна функція нововідкритої речовини була неясна, і довгий час ДНК вважалася запасником фосфору в організмі. Більш того, навіть на початку 20 століття багато біологів вважали, що ДНК не має ніякого відношення до передачі інформації, оскільки будова молекули, на їхню думку, була дуже одноманітною і не могла містити закодовану інформацію.

Поступово було доведено, що саме ДНК, а не білки, як вважалося раніше, є носієм генетичної інформації. Одними з перших вирішальних доказів стали експерименти О. Евері, Коліна Мак-Леода і Маклін Мак-Карті (1944 рік) з трансформації бактерій. Їм вдалося показати, що за так звану трансформацію (придбання хвороботворних властивостей нешкідливою культурою у результаті додавання до неї мертвих хвороботворних бактерій) відповідає виділена з пневмококів ДНК. Експеримент американських учених Алфреда Хершу і Марти Чейз (1952 рік) з міченими радіоактивними ізотопами білками і ДНК бактеріофагів показали, що в заражену клітку передається тільки нуклеїнова кислота фага, а нове покоління фага містить такі ж білки і нуклеїнову кислоту, як і початковий фаг .

До 50-х років 20 століття точна будова ДНК, як і спосіб передачі спадкової інформації, залишалася невідомою. Хоч і було напевно відомо, що ДНК складається з кількох ланцюжків, що у свою чергу складаються з нуклеотидів, ніхто не знав точно, скільки цих ланцюжків і як вони сполучені.

У 1953 р Дж. Уотсон і Ф. Крік, спираючись на відомі дані про структуру мономерних залишків нуклеїнових кислот і відкрите Е. Чарграфом правило згідно з яким у будь ДНК кількість аденіну дорівнює кількості тиміну, а кількість гуаніну-кількості цитозину, розшифрували рентгенограми псевдокристалічної форми ДНК. Згідно з їх моделі молекула ДНК являє собою правильну спіраль, утворену двома полінуклеотидними ланцюгами, закрученими один щодо одного і навколо загальної осі.

Згідно з гіпотезою Уотсона-Кріка, кожна з ланцюгів подвійної спіралі ДНК служить матрицею для реплікації комплементарних дочірніх ланцюгів. При цьому утворюються дві дочірні двухланцюгові молекули ДНК, ідентичні батьківській ДНК, причому кожна з цих молекул містить одну незмінену ланцюг батьківської ДНК. Гіпотеза Уотсона-Кріка була перевірена за допомогою дотепних дослідів, виконаних Метью Мезельсоном і Франкліном Сталем в 1957 р .

2.2 Методика проведення експерименту Була виміряна щільність бактерій з ізотопом [15N]. Потім було проведене центрифугування, та поділ вмісту клітин на фракції (таким чином можна виділити ДНК). Пробірку помістили у спектрофотометр, щоб виявити перевагу одного з ізотопів у пробірці. Для того, щоб встановити як діляться ДНК, бактерії були перенесені у середу з легким ізотопом [14N]. Той самий експеримент був проведений з другим та третім поколінням бактерій. Після чого була дослідження структура ДНК першого покоління. Для цього нагрівали розчин ДНК до 100° С на протязі 30 хв., на водяній бані. Потім був проведений поділ на фракції: легка — [14N], та важка — [15N]. Цим і було доведено, що у першому поколінні утворюються гібридні молекули ДНК. До їх складу входять два ланцюга: материнський, який містить [15N], та дочірній, який містить [14N] (Рис. 2.1) .

Рис. 2.1. Схема послідовних етапів експеримента Точність реплікації забезпечується компліментарною взаємодією азотистих основ матричного ланцюга і ланцюга, що будується. Крім цього, весь процес контролюється ДНК-полімеразою, що самокорегує та усуває помилки синтезу .

РОЗДІЛ 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА Кишкову паличку вирощували при 36 ° С з аерацією у глюкозо сольовій середі, що містила хлорид амонію як єдине джерело азоту. Зростання кількості бактерій проходило за наступними показниками (Рис. 3.1) .

Значення по осі ординат дає фактичні титри культур до часу додавання ізотопу 14N. Після цього, протягом періоду, коли зразки вилучаються на градієнті щільності центрифугуванням, фактично титр підтримували між 1 і 2 * 108 добавками свіжого середовища. Значення по осі ординат потім були виправлені для зняття і доповнення. Протягом періоду вибірки для градієнту щільності центрифугування, час генерації становить 0,81 години в експерименті 1 і 0,85 години в експерименті 2(Рис. 3.1).

Бактерії рівномірно мічені 15N, готували шляхом вирощування промитих клітини протягом 14 поколінь (до титру 2 * 108 мл) в середовищі, що містить 100 мкг / мл 15NH4Cl, що складає 96,5 відсотка чистого ізотопа [9,10] .

При подальшому зростанні бактерій, титр підтримували між 1 і 2 *108 мл, за допомогою відповідних добавок свіжого середовища, що містить рибози 14N. Зразки, що містять близько 4*109 бактерій були виведені з культури як раз перед додаванням 14N і потім з інтервалом протягом кількох поколінь. Кожен зразок негайно охолоджували і центрифугували на холоді протягом 5 хвилин при 1800 обертах. Після ресуспендування в 0,40 мл холодного розчину NaCl в етилендиамінтетраоцтовий ацетат, при рН 6, клітини зруйнувалися з додаванням 0,10 мл 15% додецилсульфата натрію і зберігались на холоді.

Кожен знімок був зроблений після 20 годин центрифугуванням при 44 770 обертів на хвилину, в умовах, описаних вище. Райони з рівною щільністю займають однакову вертикальну позицію на кожній фотографії. Час вибірки вимірюється з моменту додавання 14N в одиницях часу генерації. Часи поколінь для експериментів 1 і 2 оцінювалися за вимірюванням росту бактерій представленому на рис. 3. 1. Ручка мікроденситометру зміщена вище базової лінії та прямо пропорційна концентрації ДНК. Ступінь маркування виду ДНК відповідає відносній позиції її смуги між зонами мічених і немічених ДНК, показаних в нижній рамі, яка служить в якості еталону щільності. Випробування дійшли висновку, що ДНК у смузі проміжної щільності лише половина мічених відображається у кадрі, що показує суміш поколінь 0 і 1,9. При врахуванні відносних кількостей ДНК у трьох вершин, пік проміжної щільності виявляється по центру на 50 ± 2 (відсотків від відстані між 14N та 15N) [9,10] .

Для щільності центрифугуванням в градієнті, 0,010 мл додецилсульфату додали в 0,70 мл буферний розчин CsCl при pH 8,5 з 0,01 мл гідроксиметилу. Густина отриманого розчину була 1,71 г/см3. Суміш центрифугували при 44 770 обертів/хвилину при температурі 250С, на протязі 20 годин. Було досягнуто осадження. Смуги ДНК були знайдені в рйоні щільності 1,71 г/см3, добре ізольовані від усіх інших макромолекулярних компонентів бактеріального лізату. Фотографії ультрафіолетової абсорбції прийняті в ході кожного центрифугування, були відскановані записи з мікроденситрометру. Щільність молекули ДНК залежить від частки 15N, яку вона містить. Градієнт щільності є постійним в області між міченими і неміченими смугами ДНК. Отже, ступінь маркування з частково мічених видів ДНК може бути визначений з його положення між смугою міченої і групи немічених ДНК. Ступінь мічення оцінюється приблизно в 2% [9,10] .

ВИСНОВКИ У результаті виконаної курсової роботи було зроблено наступні висновки :

1. Визначено, що генетичному коду притаманні такі характеристики: триплетність (кожна амінокислота кодується послідовністю із трьох нуклеотидів — триплетом або кодоном), специфічність (один кодон відповідає лише одній амінокислот), виродженість (одна амінокислота може бути закодована кількома триплетами), колінеарність (лінійна послідовність амінокислот у білку і послідовність кодонів у нуклеїновій кислоті, яка визначає синтез даного білка, збігаються), односпрямованість (зчитування інформації в процесі транскрипції і трансляції відбувається лише в одному напрямку), неперекриваємість (останній нуклеотид попереднього кодону не належить наступному триплету), безперервність (між триплетними «словами» відсутні «розділові знаки»), універсальність (в усіх організмах одні й ті самі амінокислоти кодуються одними й тими самими нуклеотидами).

2. Показано, що молекула ДНК складається з чотирьох видів нуклеотидів (Аденін, Гуанін, Тимін, Цитозін), які складають генетичний код, що є носієм спадкової інформації.

3. Вивчено, що ДНК вперше була відкрита Іоганном Фрідріхом Мішером у 1869 р. Поступово було доведено, що саме ДНК, а не білки, як вважалося раніше, є носієм генетичної інформації. Одними з перших вирішальних доказів стали експерименти О. Евері, Коліна Мак-Леода і Маклін Мак-Карті (1944 рік) з трансформації бактерій. У 1953 р Дж. Уотсон і Ф. Крік, спираючись на відомі дані про структуру мономерних залишків нуклеїнових кислот і відкрите Е. Чарграфом правило згідно з яким у будь ДНК кількість аденіну дорівнює кількості тиміну, а кількість гуаніну-кількості цитозину, розшифрували рентгенограми псевдокристалічної форми ДНК.

4. Встановлено, що молекула ДНК ділиться порівну між двох субодиниць, які залишаються недоторканими протягом багатьох поколінь. Доведено, що кожна дочірня подвійна спіраль ДНК складається з одного старого (матричного) ланцюга і з одного, знову синтезованого ланцюга.

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. The Genetic Code. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. Cold Spring Harbor; N. Y. 1966.31.

2. Електронний ресурс: http://files.school-collection.edu.ru/

3. Електронний ресурс: http://subject.com.ua/biology/medical/34.html

4. Phyllis Pease, J. Gen. Microbiol., 1957

5. Електронний ресурс: http://drogobych.info/k/1/106.html

6. Фриленд С., Херст Л. Закодированная эволюция // В мире науки.-№ 7.-2004.

7. Гиббс У. Синтетическая жизнь // В мире науки.-№ 8.-2004.

8. Електронний ресурс: http://ua-referat.com

9. P. D. Lawley, Biochim. et Biophys. Acta, 1956.

10. Електронний ресурс: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/