Содержание аскорбінової, дегидроаскорбиновой і дикетогулоновой кислот в еритроцитах здорових малюків і потерпають инсулинзависимым цукровим диабетом

МИНИСТЕРСТВО СПІЛЬНОГО І ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО.

ОСВІТИ РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦИИ.

КРАСНОЯРСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНИВЕРСИТЕТ.

Біологічний факультет.

Кафедра біохімії і фізіології чоловіки й животных.

С.А. Костогорова студентка 4 курса.

ЗМІСТ АСКОРБІНОВОЇ, ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ І ДИКЕТОГУЛОНОВОЙ КИСЛОТ У ЕРИТРОЦИТАХ ЗДОРОВЫХ ДІТЕЙ І КОТРІ СТРАЖДАЮТЬ ИНСУЛИНЗАВИСИМЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ.

(курсова работа).

Науковий керівник: к.б.н., доц. Титова Н.М.

Красноярськ, 1999.

оглавление Введение 2 ГЛАВА 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 3 1.1.биохимические процеси при дозріванні і старінні еритроцитів 3.

1.1.1. Характеристика еритроцитів 3.

1.1.2. Енергетичний обмін в еритроцитах 5.

1.1.3. Антиоксидантна система еритроцитів 6 1.2. Аскорбат як компонент АОС еритроцитів 8.

1.2.1. Будова і фізико-хімічні властивості аскорбата 8 1.3. Цукровий діабет як із распространёенных патологічних процесів 9 ГЛАВА 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 11 2.1. Підготовка еритроцитів 11 2.2. Метод роздільного визначення аскорбінової, дегидроаскорбиновой і дикетогулоновой кислот в еритроцитах 11 2.3. СТАТИСТИЧНА ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ 13 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХНІ ОБГОВОРЕННЯ 14 ВИСНОВКИ 15 література 16 SUMMARY 19 Додаток 20.

Стиглі еритроцити ссавців — це високоспеціалізовані безъядерные клітини. Основний функцією еритроцитів є транспорт кисню від клітини до тканинам і вуглекислоти у напрямі. Високі концентрації кисню і процеси оксигенації - деоксигенации гемоглобіну зумовлюють освіту высокореакционных интермедиатов кисню, викликають порушення нормально функціонувати клітини. Існує антиоксидантна система захисту клітини від свободнорадикального окислення. У її складу входять ряд ферментів і небілкових речовин. Важливу роль антиоксидантной системі грає речовина небелковой природи — аскорбат. Він має широкий спектр антиоксидантных властивостей, зокрема, лише аскорбат досить реакционноспособен для ефективного ингибирования ініціації перекисного окислення ліпідів. Аскорбат блокує поглинання кисню й освіту перекису водню; присутність аскорбата у клітинах надає захисне дію на гемоглобін, перешкоджаючи його окислювання. Аскорбат під час виконання своїх біохімічних функцій можна зупинити перетворюється на окисленную форму — ДАК і ДКГК. Основну роль біохімічних процесах грає редокс-пара — АК/ДАК. За даними літератури, це співвідношення може змінюватися що за різних патологічних процесах, однією з поширених є інсулінзалежний цукровий діабет. Дослідження, створені задля вивчення зміни змісту АК, ДАК і ДКГК у клітинах може бути однією з критеріїв, які свідчать про наявність у організмі вищевказаних процессов.

Метою згаданої роботи стало визначення змісту АК, ДАК, ДКГК у спільній еритроцитарної масі в дітей віком, котрі страждають инсулинзависимым цукровим діабетом. Ця робота є частина досліджень, проведених спеціалісти кафедри біохімії і фізіології людини і тварин КДУ з вивчення метаболізму эритроцитов.

ГЛАВА 1. ОГЛЯД ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.биохимические процеси при дозріванні і старінні эритроцитов.

1.1.1. Характеристика эритроцитов.

Зрілий еритроцит людини спрощеної клітиною по біохімічної і структурної організації. Це високоспеціалізована без’ядерна клітина. Еритроцити людини утворюються з ядросодержащих клітин переважно у кістковому мозку. У цих попередників еритроцитів містяться субклітинні структури та ферментні системи, необхідних розподілу, дозрівання, диференціювання, процесів біосинтезу ДНК, РНК, білків, зокрема глобиного, синтезу гема, ліпідів, вуглеводів, інших сполук. І на цій стадії розвитку еритроцита здійснюються окисні процеси, тканинне подих, анаэробное розщеплення вуглеводів (гліколіз), пряме окислювання глюкози через пентозофосфатный шлях (Черняк Н.Б., 1976).

До цього часу бракує чітких уявлення про те, як співвідносяться окремі стадії дозрівання ядерних клітин із змінами хімічного складу та обміну речовин. Проте відомо, у процесі розвитку клітини на стадії нормобласта зменшується кількість РНК, збільшується зміст гемоглобіну і втрачається спроможність до синтезу ДНК, у зв’язку з ніж порушується спроможність до митотическому делению.

Ретикулоциты — безъядерные клітини, які утворюються на останньому етапі дозрівання, попередньому освіті еритроцитів, характеризуються схожою морфологією, зокрема, містять мітохондрії, рибосоми, Епр. У ретикулоцитах здійснюється біосинтез глобиного, гема, пуринов, пиридиннуклеотидов, фосфатидов, ліпідів (Федоров Н.А., Черняк Н. Б., 1976). РНК мало синтезується. Відбувається фосфорилування, сопряжённое з окисленням, і гліколіз (Гинодман Л., 1968). У обміні речовин ретикулоцитов беруть участь ендогенні і екзогенні субстрати, зокрема амінокислоти, глюкоза.

Останній етап дозрівання — перетворення ретикулоцита в еритроцит — протікає 1−3 дня. Відбуваються значних змін в обміні речовин і морфології клітин (Федоров Н.А., 1976).

У зрілих без’ядерних еритроцитах порушено біологічний апарат дихання, системи синтезу білка, пуринов, порфіринів. Зберігається спроможність до гликолизу, утилізації невеликої кількості глюкози в пентозном циклі і синтезу деяких сполук, наприклад, глутатиона.

У нормі тривалість життя еритроцитів підтримується протягом 120 днів спеціалізованими ферментними системами. Виведення еритроцитів з циркуляції пов’язані з змінами (структурних компонентів, хімічного складу, джерел енергії), котрі характеризують старіння клітин. Найбільш характерними змінами при старінні еритроцитів являются:

1) зменшення активності різних ферментів гликолиза і пентозного циклу, що знижує інтенсивність цих процесів (Мортенсен, Брайн,.

1974);

2) зменшення ліпідів, що зумовлює зміни структури еритроцитів, збільшення чутливості до осмотическому лизису і механічним воздействиям;

3) зміни у складі катионів зміною проникності мембраны;

4) зміна змісту АТР, що у своє чергу пов’язується як із одного з причин їхнього порушення проникності, і із зменшенням приживаності еритроцитів в кров’яному русле.

Однією із перших гіпотез старіння є свободнорадикальная гіпотеза, запропонована Д. Хартманом. Вона пов’язує причини вікові зміни з накопиченням молекулярних ушкоджень в мембранах і генетичному апараті клітини вільними радикалами і продуктами перекисного окислення ліпідів. Порушення нормально функціонувати клітини зумовлено високими швидкостями освіти высокореакционных интермедиатов кисню (супероксидрадикал, пероксид водню, гидроксильный радикал), що, своєю чергою, пов’язані з постійно що перебігають процесами оксигенації і деоксигенации гемоглобіну і наявністю високих концентрацій кисню під час виконання основний функції еритроцитів — транспорту кисню від клітини до тканинам і вуглекислого газу зворотному направлении.

1.1.2. Енергетичний обмін в эритроцитах.

Задля підтримки функціональної активності клітин організму необхідна витрата енергії. Стиглі еритроцити, що циркулюють у кров’яному руслі, є метаболически активними клітинами, попри відсутність здатність до синтезу білків, аэробному розщеплення глюкози в лимоннокислом циклі Кребса (Владимиров Г. Е. по Рапопорту, 1970). Основним процесом обміну енергії у яких є гліколіз. Процес, протекающий в еритроцитах, близький до процесів за іншими клітках і тканинах, та детально описаний (Федоров Н.А. по Райкеру, 1976).

До особливостям гликолиза в еритроцитах можна віднести використання, крім глюкози, інших моносахаридов: фруктози, маннозы, галактозы, і навіть инозина, сорбита за наявності відповідних ферментів (Йошикава, 1968). У процесі гликолиза відбувається освіту АТР і NADH. Енергія гликолиза використовується для активного транспорту катионів через клітинну мембрану і підтримки співвідношень між іонами калію і натрію в еритроцитах і плазмі, задля збереження цілісності мембрани і двояковогнутой форми клітини. Утворений NADH використовується на відновлення пировиноградной кислоти в молочну й у відновлення метгемоглобіну з участю метгемоглобинредуктазы. У складі метгемоглобіну міститься трёхвалентное залізо, внаслідок чого воно неспроможний до транспорту кисню. Характерною особливістю гликолиза в еритроцитах є перетворення 1,3- дифосфоглицерата у 3-фосфоглицерат, а й у 2,3- дифосфоглицериновую кислоту під впливом дифосфоглицеромутазы. 2,3- дифосфоглицерат має, поруч із АТР, важливого значення в регуляції спорідненості гемоглобіну до кисню. Принаймні старіння еритроцита відбувається зменшення здатність до відновленню метгемоглобіну в гемоглобін, тобто. порушення функціональної активності еритроцита. Це пов’язано саме із зменшенням інтенсивності гликолиза, у результаті якого утворюється NADH, необхідний на дію метгемоглобинредуктазы. Зменшення змісту 2,3- дифосфоглицерата призводить до зрушенню диссоциационной кривою вліво, погіршення віддачі кисню тканям.

Результатом всіх реакцій гликолиза є перетворення 1 молекули глюкози в 2 молекули молочної кислоти з одночасним перетворенням 2 молекул ADP у два молекули АТР.

Поруч із гликолизом — анаэробным розщепленням глюкози до молочної кислоти — в еритроцитах існує додатковий шлях утилізації глюкози — пряме окислювання до вуглекислого газу й води під час пентозофосфатного циклу. Цей шлях невідрізнимо аналогічних процесів, що відбуваються за іншими клітках і тканинах; сумарним результатом циклу є окислювання одній з 6 молекул глюкозо-6-фосфата до 6 молекул СО2 та своєчасне відновлення 12 молекул NADPH. Роль пентозного циклу у стиглих еритроцитах полягає, з одного боку, в освіті пентозофосфатов. У реакції циклу утворюється 3- глицероальдегидфосфат, подвергающийся перетворенням у ланцюзі гликолитических реакцій отже, є додатковим джерелом енергії. Основне значення пентозофосфатного циклу укладено освіти молекул NADPH. Значення NADPH визначається її через участь у ряді реакцій, необхідних підтримки функціональної активності і цілісності еритроцитів. До них ставляться відновлення метгемоглобіну в гемоглобін з участю NADPH і метгемоглобинредуктазы та своєчасне відновлення окисленого глутатиона з допомогу. NADPHглутатионредуктазы. Відновлений глутатион (GSH), форма зі вільно реагує тиоловой групою становить еритроцитах до 96% загальної кількості. Збереження глутатиона у стані необхідне запобігання низки ферментів, містять SHгрупи, від інактивації, огородження мембрани клітини від дії перекисів і необоротного окисного денатурирования гемоглобина.

1.1.3. Антиоксидантна система эритроцитов.

Основна функція еритроцитів — транспорт кисню від легких до тканинам і СО2 у напрямі. Завдяки високим концентрациям кисню і постійно протекающим процесам оксигенації - деоксигенации гемоглобіну, в цих клітинах дуже швидко йдуть процеси освіти вільних радикалів: Н2О2, ВІН-. З іншого боку, в еритроцитах внаслідок аутокаталитических реакцій утворюються перекису і гидроперекиси липидов.

Основне кількість О2- в еритроцитах утворюється під час аутоокислении гемоглобіну в метгемоглобин. Це приклад генерації супероксидного радикала, що з неферментативным окисленням субстрата:

Hb + O2 (Hb…O2 (MetHb + O2;

Велику роль захисту клітини від вільних радикалів грають ферментативные антиоксиданти. Еритроцити містять высокоактивную супероксиддисмутазу, яка проводить дисмутацию двох O2- з освітою перекису водорода:

O2- + O2- (H2O2 + O2.

Новоутворена перекис водню, що є найсильнішим окислювачем, частково нейтралізується неферментативным шляхом з участю аскорбата чи інших антиоксидантів ((-токоферол, глутатион відновлений). Основне кількість Н2О2 розщеплюється в реакціях, катализируемых каталазой і глутатионпероксидазой:

Н2О2 + Н2О2 (2Н2О + О2.

Н2О2 + RH2 (2Н2О + R.

Важливу роль антиоксидантной системі еритроцитів грають легкоокисляющиеся пептиди, містять амінокислоти з SH-группой: метіонін, цистеин. Особливе його місце займає глутатион — трипептид, освічений цистеином, глутаматом, глицином. У організмі він у окисленої і відновленої формі (GSH). Основний антиоксидантний ефект глутатион надає, беручи участь у роботі ферментативних антиоксидантів. Глутатион є ингибитором активованих кисневих радикалів і стабілізатором мембран. Це з тим, що SHщо містять сполуки піддаються окислювання насамперед, що охороняє від окислення інші функціональні группы.

Досить важливий внесок у захист клітини від органічних радикалів вносять неферментативные антиоксиданти. Ефективними перехватчиками органічних радикалів є фенольные антиоксиданти, які мають у структурі ароматичне кільце, що з одна чи кілька гидроксильными групами. Є кілька тисяч фенольних сполук, які мають антиоксидантным ефектом: вітаміни групи Є. і До, триптофан, фенилаланин, убихиноны, більшість тварин і звинувачують рослинних (каротиноїди, флавоноїди) пігментів. Синтезується ароматичне кільце тільки в вищих рослин i мікроорганізмів, тому з фенольних антиоксидантів входять до групи облигатных харчових, які ефективно інгібірують О2-, ВІНі индуцируемые ними процеси перекисного окислення (Оксенгендлер, 1985).

Антиоксидантными властивостями мають хелатные сполуки, котрі пов’язують метали перемінної валентності (церулоплазмін, сечова кислота, трансферин). Цим вони перешкоджають залучення в реакції розкладання перекисів, що у присутності металів перемінної валентності освіту высокореакционных радикалів посилюється (Эристер, 1987).

Отже, розвиток виробництва і функціонування клітин на кисневмісною середовищі неможливо без існування захисних систем — спеціалізованих ферментативних і неферментативных антиоксидантів. У живих організмах постійний процес освіти прооксидантов, уравновешиваемый дезактивацией їх антиоксидантными системами. Для підтримки гомеостазу регенерація антиоксидантів повинна бути безперервною. Відсутність чи порушення у її безупинної роботі призводить до розвитку окисних процесів, до накопичення окисних ушкоджень, що супроводжує ряд патологічних фізіологічних процесів, наприклад, старіння (Оксенгендлер, 1985).

4 Аскорбат як компонент АОС эритроцитов.

1 Будова і фізико-хімічні властивості аскорбата.

Вітамін З (L-аскорбиновая кислота) входить до складу алифатического низки вітамінів. З власного будовою може належати до похідним вуглеводів. Це ?-лактон 2,3-дегидро-L-гулоновой кислоти, похідне ненасичених полиокси-?-лактонов. Структура близька структурі (-глюкозы.

Наявність двох асиметричних атомів вуглецю на чотири і п’яти положеннях, аскорбінова кислота (АК) утворює 4 оптичних ізомеру і 2 рацемата. Dі Lаскорбиновые кислоти у природі невідомі і синтезовано штучним путём.

Наявність у АК двох сопряжённых подвійних зв’язків (углерод-углеродной і углерод-кислородной) зумовлює її спроможність до обратимому окислювання, продуктом якого є дегидроаскорбиновая кислота (ДАК). ДАК стійка, та її лактонное кільце, на відміну стабилизированного подвійний зв’язком лактонного кільця L-АК у водному розчині легко гидролизуется з освітою 2,3-дикетогулоновой кислоти (2,3-ДКГК). Ця реакція необоротна, її швидкість зростає у разі підвищення температури і рН середовища. Через ряд подальших перетворень ДКГК перетворюється на щавлеву і L-треоновую кислоти. Така ж перетворення має місце у організмі (Халмурадов, Тоцкий, 1993):

Здатність до У перетворенням, що з ендольной угрупованням, яка стабілізовано що у циклі сусідньої карбонильной угрупованням, супроводжується перенесенням атомів водню до акцепторам, є важливим каталітичної функцією АК в живий організм. L-АК по своєї біологічну активність высокоспецифична. Вітамінна активність виявляється лише за наявності вільних гідроксильних груп. Різні функціональні похідні із них позбавляють молекулу вітамінною активності майже зовсім, як і гідрування ненасиченої зв’язку лактонного кільця. Тому L-ДАК має вітамінну активність, рівноцінну L-АК, тоді як 2,3- ДКГК її цілком позбавлена. У результаті легкої окисляемости L-АК — донор М+, вона кількісно легко відновлює численні сполуки, якось: йод, перманганат калію та інші. L-АК — переносник М+ у деяких ферментативних реакціях живою клітиною, вона часто окислюється пероксидазой, цитохромоксидазой, каталазой. L-АК відновлює окислені форми ферментів, окисляючи в ДАК, можна зупинити легко регенерирующуюся в АК під дією глутатиона з допомогою його сульфгидрильной группы:

[pic].

[pic].

[pic].

[pic].

Окислювання АК каталізується міддю, меншою мірою — катионами срібла і заліза. Є припущення, що специфічним каталізатором окислення АК в тварин організмах є білок, синтезирующийся у печінці, здійснює транспорт міді, у якого оксигеназной активністю, — церулоплазмін. У меншою мірою окислювання аскорбата катализируют інші катиони, зокрема, срібла і заліза. Комплексоны, флавоноїди гальмують окисний розпад АК. Деякі білки інгібірують окислювання АК, зв’язуються зі ній чи шляхом освіти комплексу з міддю — сывороточные глобулины (Борець, 1980). Окислювання гальмується -SH що містять сполуками: сірчиста кислота блокує фермент аскорбиназу; С-SH пов’язує іони Cu+, видаляючи т. з. каталізатор окислення АК з реакції (Киверин, 1971).

1.2.2. Біосинтез АК в живому организме.

L-АК синтезується в рослинах і організмі деяких тварин із Dглюкози через лактон D-глюкуроновой кислоти і L-гулоно-?-лактон чи його похідне. У процесі біосинтезу відбувається перетворення сполук D-ряда в сполуки L-ряда (Березовський, 1993):

Біосинтез АК в організмі тварин відбувається у клітинах печінки, нирок, надниркових залоз, гіпофізу, стінки тонкого кишечника (Киварин, 1973).

1.2.3. Фізіологічні властивості аскорбата.

Вітамін З є постійною складовою тканин та органів людини. Його потрапляння до організму має бути щоденним, т. до. аскорбат, граючи значної ролі в обмінних процесах організму, постійно витрачається. Він відновлює окислені форми ферментів, активує деякі протеази, гальмує дію амилазы і протеази підшлункової залози, активує эстеразу печінки. L-АК бере участь у обмін деяких ароматичних амінокислот, регулює рівень холестерину у крові, посилює антитоксичні функції гепатоцитів (разом із глюкозою), норамализирует белковообразование. Вітамін З необхідний нормального функціонування клітин, які продукують колаген, активує і регулює зритропоэз (сприяючи засвоєнню заліза), нормалізує порушене протромбинообразование, нормалізує процеси згортання (Андрєєв; 1996). Аскорбат грає позитивну роль розвитку імунних реакцій організму, має деяким детоксицирующим властивістю, є важливим чинником профілактики і лікування інфекційних заболеваний.

Вітамін З надає позитивний вплив на вуглеводний обмін. Волинський З. М. з працівниками показали, що підвищує синтез глікогену в печінки, І що наростання змісту глікогену у печінці, зазвичай, прямо пропорційно підвищенню у цьому органі вітаміну З. Такого висновку дозволяють прийти численні клінічні спостереження того, що підтверджують цінне властивість АК мати нормализующим дією на рівень цукру на крові. Такий ефект пов’язані з синергическим дією аскорбата і гормонів — інсуліну і адреналіну. Вітамін З може посилювати дію інсуліну чи діяти аналогічно йому, сприяючи освіту глікогену у печінці. Синергізм виникає непрямим шляхом через вплив інсуліну і вітаміну З на общегормональный фон организма.

Отже, АК надає різнобічніша впливом геть процеси обміну речовин у здорових людей, а що за різних патологічних станах сприяє нормальний перебіг обміну речовин та функціонування різних органів прокуратури та систем організму (Бременер; 1997).

5 Цукровий діабет як із поширених патологічних процессов.

Діабет цукровий (diabetes mellitus; цукрова хвороба, цукрове мочеизнурение) — ендокринна захворювання, обумовлене дефіцитом гормону інсуліну в організмі або його низькою біологічну активність; характеризується хронічним течією, порушенням всіх видів обміну речовин, ангиопатией.

Цукровий діабет є саму распространённую ендокринну патологію. У її розвитку істотну роль грають спадкова схильність і несприятливий вплив довкілля, проте, характер спадкової схильності й дуже звані чинники ризику різні в різних типах цукрового діабету. Чинниками ризику цукрового діабету є поява антитіл до (-клітинам острівців підшлункової залози, часті вірусні інфекції, гіподинамія, ожиріння, нераціональне чи недостатнє харчування, стреси, генетично обтяжений по цукрового діабету анамнез і другие.

Відповідно до класифікації ВООЗ, розрізняють дві основні типу цукрового діабету. Це інсулінзалежний (I тип) і инсулиннезависимый (II тип) цукровий діабет. Інсулінзалежний цукровий діабет, зазвичай, розвивається що в осіб молодого віку і її дітей, мають генетичну схильність до цукрового діабету саме такого типу. Инсулиннезависимым на цукровий діабет частіше хворіють особи, старше 50 років (особливо жінки). Спадкова схильність грає великій ролі, аніж за цукровому діабеті I — типа.

Механізм розвитку цукрового діабету складний і багатогранний. Він залежить як від функції самої підшлункової залози, і від внепанкреатических чинників. Насамперед, порушений обмін вуглеводів. Через брак інсуліну чи інших причин не може перехід глюкози в м’язову і жирову тканину, знижується синтез глікогену у печінці, посилюється освіту глюкози з білків і жирів (глюконеогенез). У розвитку цих процесів збільшується зміст глюкози у крові. Якщо нормі досить стало й натщесерце у здорових людей коливається не більше 3,33 — 35,55 ммоль/л (70 — 100 мг%), то, при цукровому діабеті залежно від форми й тяжкості течії зазвичай перевищує 6,00 ммоль/л, досягаючи 20 -30 ммоль/л і больше.

Діабет в дітей віком і підлітків характеризується важким перебігом і, як правило, гострим початком захворювання. Від часу появи перших ознак захворювання (жага, похудание, виділення великої кількості сечі, загальна слабкість, сухість шкіри) до розвитку важкого гніву й значних порушень обміну речовин, проходить зазвичай 2 тижня. Діти, хворим діабетом, вимагають обов’язкового лікування та профілактики постійного лікувального контроля.

ГЛАВА 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДЫ.

Нами обстежений 41 дитина, страждальців инсулинзависимым цукровим діабетом, і десяти людина контрольної групи. Об'єктом дослідження служили еритроцити з онкозахворюваннями та здорових малюків. Для отримання еритроцитів кров брали з ліктьовий вени краплинним способом, як антикоагулянта використовували гепарин.

Дослідження проводили у спільній еритроцитарної масі дітей, котрі страждають инсулинзависимым на цукровий діабет, та дітей контрольної группы.

2.1. Підготовка эритроцитов.

Свіжу гепаринизированную кров розливали в центрифужные пробірки по 5 мл. Після пятнадцатиминутного центрифугування при 3000 об./хв при 40 З відбиралися і відкидали лейкоцитарный шар і плазма. Еритроцити суспендировали в десятикратному обсязі 0.9% розчину NaCl і центрифугировали протягом п’ятнадцяти хвилин при 3000 об./хв. Супернатант відсмоктували, процедуру повторювали 3 разу. Це робилося ще щільною упаковки эритроцитов.

2.2. Метод роздільного визначення аскорбінової, дегидроаскорбиновой і дикетогулоновой кислот в эритроцитах.

Для кількісних визначень АК, ДАК і ДКГК використовували метод J.H. Roe, C.A. Kuether (1943) в модифікації В. В. Соколовського, Л. В. Лебедєвої, Т. Б. Лиэлуп (1967). Метод грунтується на взаємодії 2,4- динитрофенилгидразина з ДАК із заснуванням в сірчаної кислоті відповідного озазона. ДАК і ДКГК дають червоне забарвлення, що використовується для фотометрического визначення. Для обчислення суми всіх кислот їх окисляют 2,6- дихлорфенолиндофенолятом натрію. Зміст АК визначають по різниці. Для диференційованого визначення ДАК і ДКГК суміш піддають дії відновлювачів, причому у АК відновлюється лише ДАК. У ролі відновлювача використовували димеркаптопропансульфонат натрію (унитиол).

Реактивы:

1. 2.10 М унітіол (0.84 мл 5% розчину ампулированного препарат в 100 мл.

0.2 М фосфатного буфера рН 7.0. зберігати трохи більше суток).

2. 5% трихлоруксусная кислота (ТХУ). Зберігати не в холодильнику трохи більше двох недель.

3. 85% розчин сірчаної кислоти (100 мл води + 900 мл концентрованої сірчаної кислоты).

4. 2% розчин 2,4-динитрофенилгидразина в 9Н сірчаної кислоті, содержащей.

0.25% тиомочевины (зберігати не в холодильнику трохи більше 1 месяца).

5. 0.001 М розчин 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрію (краска.

Тильманса). Зберігати у темряві трохи більше 1 недели.

6. 0.9% розчин хлориду натрію (фізіологічний раствор).

Хід определения.

О третій пробірки поміщали по 0.5 мл упакованих і відмитих від плазми еритроцитів з заздалегідь відомим гематокритом. У перший додавали 0.25 мл фізіологічного розчину і 0.25 мл унітіолу. Після п’ятнадцятихвилинної інкубації при періодичному помішуванні суспензії відбирали 0.5 мл екстракту, якого додавали 1.5 мл ТХУ.

У дві інші пробірки також додавали по 1.5 мл ТХУ.

У дві пробірки вносили по 0.75 мл супернатанта, отриманого при центрифугировании суміші упакованих еритроцитів з ТХУ. У жодну з пробірок додавали по краплях 0.001 М розчин 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрію до появи слаборозового фарбування, стійкого за тридцяти секунд. У третю пробірку поміщали 0.75 мл супернатанта, отриманого після центрифугування суміші упакованих еритроцитів з фізіологічним розчином, унитиолом і ТХУ. В мені весь пробірки додавали по 0.25 мл 2,4- динитрофенилгидразина і доводили обсяг до 1.25 мл дистильованої водою, инкубировали при 100 0 З протягом десяти хвилин і прохолоджували у крижаній лазні. У кожну пробірку додавали невеликими порціями 1.25 мл 85% розчину сірчаної кислоти, прохолоджуючи у крижаній лазні після кожної порції. Забарвлені розчини фотометрировали за годину при довжині хвилі 540 нм.

Концентрацію кислот визначали по формуле:

З = (3*А)/0.085; где.

З — концентрація кислот, мг%.

3 — концентрація стандартного розчину, мг%.

А — оптична щільність пробы.

0.085 — оптична щільність стандартного раствора.

2.3. СТАТИСТИЧНА ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТОВ.

Результати досліджень оброблялися статистично (Лакин І.А., 1976).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХНІ ОБСУЖДЕНИЕ.

Метою дослідження було визначення змісту аскорбата та її окислених форм — ДАК і ДКГК у спільній еритроцитарної масі дорослих, котрі страждають ИЗСД, зі стажем недуги помирає понад 10 років; порівняння і зіставлення отриманих результатів з цими, отриманими раніше, під час роботи з здоровими дітьми і страждаючими ИЗСД. Під час експерименту брав участь 21 дорослий віком від 25 до 40 років, 37 хворих дітей і велика група контролю, куди входять 10 здорових малюків. Результати досліджень відбито на диаграммах.

Мал.1. Зміст загальної АК, АК, ДАК і ДКГК в еритроцитах здорових малюків та дітей, котрі страждають ИЗСД (мг%).

Рис. 2. Зміст загальної АК, АК, ДАК і ДКГК в еритроцитах дорослих, котрі страждають ИЗСД (мг%).

Відповідно до отриманих результатів, в еритроцитах дітей і дорослих, котрі страждають ИЗСД, спостерігається збільшення змісту окисленої форма АК-ДАК, що може засвідчувати щодо порушення процесу відновлення АК в ДАК, більшому участі АК в метаболічних процесах, порушенні транспорту АК в клетке.

Відсоткове зміст загальної АК, АК, ДАК і ДКГК також демонструє превалювання окислених форм АК над восстановленной.

Рис. 3. Зміст загальної АК, АК, ДАК і ДКГК в еритроцитах здорових малюків і потерпають ИЗСД (%).

Рис. 4. Зміст загальної АК, АК, ДАК і ДКГК в еритроцитах дорослих, котрі страждають ИЗСД (%).

Усі отримані дані узгоджуються з цими літератури про зміну загальної кількості АК в організмі під час патології (нормальне зміст становить 5 — 15 мг%) і співвідношення «окислена форма АК/восстановленная форма АК» у бік зростання первой.

ВЫВОДЫ.

1. Зміст загальної АК в еритроцитах дітей і дорослих, котрі страждають ИЗСД, становить 19.52 мг% і 6,47 мг%, в еритроцитах здорових малюків -.

12.48 мг%.

2. Зміст відновленої АК в еритроцитах хворих дітей і дорослих становить 4.1 і 2,01 мг% (20.5 і 31% загальної АК), в еритроцитах здорових малюків — 4.28 мг% (33%).

3. Зміст окислених форм АК — ДАК і ДКГК в еритроцитах хворих дітей і дорослих становить 15.5 і 4.46 мг% (79.5 і 69% від общей.

АК), в еритроцитах здорових малюків — 8.36 мг% (67%).

4. У загальній еритроцитарної масі хворих дітей співвідношення окислена форма АК/ відновлена форма АК становить 4/1, що свідчить про привілеї окисленої форми АК над восстановленной.

5. У загальній еритроцитарної масі здорових малюків це співвідношення равно.

2/1, тобто., очевидна тенденція до зростання змісту відновленої АК.

Заключение

.

Давно вже довели те що, що аскорбінова кислота є постійної складовою тканин та органів людини. Важливість виконуваних нею фізіологічних функцій підлягає сумніву. Деякі їх давно відомий і добре вивчені. Наприклад, те, що вітамін З надає сприятливий вплив працювати імунної системи, нормалізує эритропоэз і продукцію колагену, є компонентом антиоксидантной системи клітини. Проте численні дослідження останнього часу показали, можливості цієї речовини значно ширшим, ніж уявлялося досі. Приміром, було знайдено цінне властивість аскорбата нормалізувати рівень цукру на крові, надаючи позитивний вплив на вуглеводний обмін. За виконання та інших біохімічних функцій аскорбінова кислота можна зупинити окислюється в ДАК, при наступному вплив окислювача необоротно перетворюється на ДКГК. За даними літератури, співвідношення «окислена форма АК/восстановленная форма АК» може змінюватися при різних патологіях, як і його загальний вміст в організмі. Однією з поширених патологій є інсулінзалежний цукровий діабет. Оскільки ИЗСД є ендокринної патологією, плинною з порушенням вуглеводного обміну, в регуляції якого аскорбат багато важить, було логічною припустити, що його вміст у організмі хворого виявиться іншим, ніж в здорової людини. Експериментальні дані підтвердили це припущення. У організмі хвору дитину зміст загальної АК підвищено на 37% проти загальної АК і як 19,52 мг%, тоді як нормальним вважається наявність від 5 до 15 мг% аскорбата. Середнє значення АК у здорової дитини — 12,48 мг%. Тоді як зміст ДКГК у відсотковому співвідношенні мало змінено і в з онкозахворюваннями та здорових малюків 46 і 49,4% відповідно (6,16 мг% і 8,96 мг%), концентрація ДАК в хворих дітей підвищена проти здорових майже вдвічі більше і становить 33,5% замість 17,6% (6,54 мг% і 2,2 мг%). Основні відмінності виявляються у відсотковому змісті відновленої форми АК. Її зміст у здорових малюків становить 33% загальної АК (4,28 мг%), тоді як в хворих дітей вона нижча на13% і як 4,1 мг%. Отже, співвідношення «окислена форма АК/восстановленная форма АК» в хворих дітей становить 4:1, на відміну здорових малюків, які мають воно дорівнює 2:1.

З цих даних можна припустити такі причини подібних змін змісту загальної АК і його метаболічних форм в організмі хворих ИЗСД детей:

1) При ИЗСД порушено всі види обміну речовин, у організмі - вуглеводний, білковий і жировій. У разі зростає кількість вільних радикалів, унаслідок чого АОС має велику нагрузку.

Зростає на утримання однієї з його компонентів — аскорбата, він понад активно входить у метаболічні процеси, можливо, тим самим у певною мірою компенсується зниження концентрації іншого її компонента — С-SH;

2) Майже подвоєння рівня ДАК в організмі хвору дитину при практично незмінної кількості ДКГК може можуть свідчити про порушенні процесу відновлення ДАК в АК; можливо знижена активність ферменту ДАК — редуктазы. При ИЗСД її активність знижена на 50%, що зумовлює скорочення содержанияС-SH, який буде необхідний процесу відновлення ДАК в АК. Одночасно знижується активность.

ГБФДГ, у реакції якої утворюється необхідний роботи С-R NADPH;

3) Порушення транспорту АК в клетке.

Трохи інша картина щодо дорослих, котрі страждають ИЗСД. Тут загальний вміст АК перебуває близько до нижньої межі норми і становить 6,47 мг%. Зміст ДКГК становить 11,4% (0,73 мг%), ДАК — 57,6% (3,73 мг%), АК — 31% (2,01 мг%). Зіставляючи ці показники з такими в дітей віком, можна зрозуміти, що активна АК у роботі АОС вирішено не кількісним, а якісним шляхом. Так, частка неактивною ДКГК становить 11%, тоді як у частку метаболически активних АК і ДАК доводиться 89% від загальної кількості АК. Таке превалювання активних форм АК особливо у поєднані із підвищеним змістом АК може вказувати на своєрідну «адаптацію» ферменту ДАК-редуктазы під час багаторічного лікування хвороби (понад 10 років). На підтвердження даних припущень і з’ясування механізму приспосабливаемости (якщо є) необхідні подальші исследования.

Нині точно сказати можна таке: страждають ИЗСД, особливо діти, у процесі лікування потребують проведенні антиоксидантной терапии.

1. Абрамова Ж. И., Оксенгендлер Г.І. Людина й противоокислительные речовини. -Л.:Наука, 1985. -230 С.

2. Авраамова Т. В., Титова М. М. Посібник із великому биохимческому практикуму. -Красноярськ: Вид-во КДУ, 1978, ч.1. -С.80−82.

3. Асатіані В.С. Ферментні методи аналізу. -М.:Наука, 1969. -С.26−40.

4. Ахромєєва Г.І. Визначення дегидроаскорбиновой кислоти у харчових продуктах //Питання харчування. -1988. -№ 3. -С.66−88.

5. Ашкіназі И. Я. Руйнування еритроцитів // Фізіологія системи крови.

Фізіологія эритропоэза. -Л.:Наука, 1979. -С.274−334.

6. Березовський В. М. Хімія вітамінів. -М.:Пищевая промисловість, 1973.

-С.230−300.

7. Борець В. М. Вітаміни. -М.:Наука, 1980. -29 С.

8. Бохински Р. Сучасні погляди в біохімії. -М.:Мир, 1987. -С.120;

154.

9. Браунштейн А.Є. Процеси і ферменти клітинного метаболизма.

-М.:Наука, 1987. -44С.

10. Бременер С. М. Вітаміни. -М.:Медицина, 1974. -194С.

11. Бреслер В. М., Никіфоров А. А. Транспорт органічних кислот через плазматические мембрани диференційованих епітеліальних шарів у хребетних. -Л.:Наука, 1981. -С.52−111.

12. Букін В.М. Біохімія вітамінів. -М.:Наука, 1982. -С.17−19.

13. Владимиров Г. Е. Про енергетичної функції АТФ у клітині. -Л.:Наука,.

1980. -44С.

14. Гаврилов О. К., Козинец Т. И., Черняк Н. В. Клітини кісткового мозку і периферичної крові. -М.:Медицина, 1985. -288С.

15. Галактионов С. Г. Біологічно активні. -М.:Молодая гвардія, 1988.

-С.4−84.

16. Григор'єв Г. П. Цитохром Р-450 і вітамін З //Питання харчування. -1983.

-№ 4. -С.5−10.

17. Дегли З., Нікольсон Д. Метаболічні шляху. -М.:Мир, 1973. -С.189;

196.

18. Домбровская Ю. В. Вітамінна недостатність в дітей віком. -М.:Медицина,.

1983. -63С.

19. Єфімов О.С., Бездробный Ю. В. Структура і функції інсулінових рецепторів. -Киев.:Наукова думка, 1987. -С.4−104.

20. Канунго М. Біохімія старіння. -М.:Медицина, 1982. -194С.

21. Киверин М. Д. Вітамін З повагою та профілактика С-витаминозных станів на.

Півночі. -Сев.-Зап. книжкове вид., 1971. -С.5−7.

22. Кон Р. М. Рання діагностика хвороб обміну речовин. -М.:Медицина,.

1986. -С.17−42.

23. Косяків К.С. Клінічна біохімія. -Л.:Медицина, 1997. -С.113−118.

24. Меньщикова Е. Б., Зенков М. К. Антиоксиданти і інгібітори радикальних окисних процесів // Усп. совр. биол. -1993. -№ 4. -С.442−455.

25. Мережинский М. Ф. Порушення вуглеводного обміну при захворюваннях людини. -Минск.:Медицина, 1987. -С.22−28.

26. Моїсєєва О.И. Фізіологічні механізми регуляції эритропоэза.

-Л.:Наука, 1985. -185С.

27. Мосягина О. Н., Володимирська Е. Б. Кінетика эритрона //Кінетика ферментативних елементів крові. -М.:Медицина, 1976. -С.101−122.

28. Мосягина О. Н., Федоров Н. А., Гудим В.І. Эритропоэз // Нормальне кровотворення та її регуляція /Під ред. Н. А. Фёдорова. -М.:Медицина,.

1976. -С.341−457.

29. Нове в гематології /Під ред.А. И. Воробьёва, Ю. И. Лория.

-М.:Медицина, 1974. -С.18−22.

30. Новикова С. Г. На прийомі хворий на цукровий діабет //Здоров'я. -1997.

-№ 3.-С.14−19.

31. Спиричев В. Б. Врождённые порушення обміну вітамінів. -М.:Медицина,.

1995. -С.12−19.

32. Патологічну біохімія /Під ред. А. Ф. Симёнова. -М.:Медицина, 1994.

-С.130−147.

33. Рубіна Х.М. Біохімія еритроцитів //Фізіологія системи крови.

Фізіологія эритопоэза. -Л.:Наука, 1978. -С.211−232.

34. Рубіна Х.М. Деякі даних про зв’язку метаболізму еритроцитів зі своїми киснево-транспортної функцією //Проблеми гематології і переливання крові. -1973. -№ 8. -35С.

35. Рысс М. Н Вітаміни. -Л.:Наука, 1963. -С.3−9.

36. Вільні радикали в біології /Під ред. У.Прайор. -М.:Мир, 1979.

-С.272−308.

37. Смирнов Н.І. Вітаміни. -М.:Медицина, 1974. -С.34−40.

38. Соколовський В. В., Лебедєва Л. В., Лиэлуп Т. Б. Визначення аскорбінової, дегидроаскорбиновой і дикетогулоновой кислот в біологічних тканинах // Лаб.дело. -1967. -№ 12. -С.160−162.

39. Суровова О. П. Вітаміни у нашій раціоні // Здоров’я. -1997. -№ 2.

-С.17−20.

40. Схимниковский Б. Г. Авітамінози в дітей віком //Здоров'я. -1998. -№ 6. -С.11;

13.

41. Черницкий Е. А., Воробей А. В. Структура і функції еритроцитарних мембран. -Мінськ: Наука і, 1981. — С.23−56.

42. Черняк Н. Б. Біохімічні процеси при дозріванні і старінні еритроцитів //Нормальне кровотворення та її регуляция.

-М.:Медицина, 1976. -С.159−186.

43. Baker W.I. Urate and ascorbate: their possible roles as antioxidants in determining longevity of mammalian species //Arch. Biochem. and.

Biophis. -1987. -№ 2. -Р.451−457.

44. Basu P. S., Som P. S., Ded P. S. Dehydroascorbic acid reduction in human erythrocytes //J. Chromatogr. Biomed. Appl. -1991. -№ 1−2. -Р.529;

542.

45. Burns J., Evans З. Ascorbic acid in human erythrocytes // J. Biol.

Chem. — 1996. — № 4. — P. 223−241.

46. Penney J., Zilua P. S. Role of ascorbate in our organism // J. Biochem.

— 1994. — № 2. — P. 37−49.

47. Pradhu H.R., Krishnamurthy P. S. Inhibition of ascorbate autooxidation by human blood //Curr. Sci. (India). -1986. -№ 8. -Р.403−405.

48. Sahashi Y., Mioki T., Hasegama T. Reduction of ascorbate in erythrocytes // J. Vitaminol. — 1996. — № 12. — P.6 — 14.

49. Thompson R.Q. Ascorbic acid content of plasma and cellular components of blood //Anal.Chem. -1987. -№ 8. -Р.1119−1121.

50. Yamazaki M., Mioki T. Ascorbic acid is cellular components // J.

Ferment. Technolog. — 1995. — № 7. — P. 422−513.

SUMMARY.

The main aim of this work is the study of concentration ascorbic acid, dehydroascorbic acid and DCGA in the human’s erythrocytes. The concentrations of the AA, DAA & DCGA were learned in the common erythrocytes mass.

Our results showed that concentration of AA is lower that concentration of DAA, DCGA.

Додаток 1.

Зміст АК, ДАК і ДКГК в еритроцитах дітей, котрі страждають инсулинзависимым на цукровий діабет (мг%) |№ |(АК |ДКГК |ДАК |АК | |1 |27,32 |13,06 |7,9 |6,36 | |2 |27,68 |16,66 |8,9 |2,12 | |3 |12,56 |5,3 |3,52 |3,74 | |4 |17,86 |10,02 |4,16 |3,68 | |5 |19,78 |11 |6,36 |2,42 | |6 |17,84 |10,66 |6,70 |0,84 | |7 |26,64 |12,14 |7,8 |6,7 | |8 |13,18 |4,14 |3,88 |5,16 | |9 |18,04 |10,26 |4,40 |3,38 | |10 |19,74 |11,12 |6,22 |2,4 | |11 |27 |16,94 |8,06 |2 | |12 |18,14 |10,8 |6,82 |0,52 | |13 |19,76 |8,48 |4,24 |7,04 | |14 |14,82 |8,32 |5,30 |1,2 | |15 |27,52 |8,48 |9,32 |9,68 | |16 |17,01 |8,15 |6,8 |2,06 | |17 |19,5 |7,01 |9,1 |3,39 | |18 |16,4 |6,4 |5,43 |4,57 | |19 |17,7 |5,22 |7,92 |4,56 | |20 |12,4 |4,81 |6,1 |1,49 | |21 |16,33 |7,49 |6,4 |2,44 | |22 |17,77 |6,29 |9,2 |2,21 | |23 |23,27 |10,01 |7,6 |5,66 | |24 |18,8 |7,26 |8,13 |3,41 | |25 |20,5 |8,16 |7,3 |5,04 | |26 |22,55 |9,25 |6,24 |7,06 | |27 |17,74 |9,14 |6 |2,6 | |28 |19,22 |7,17 |7,3 |4,75 | |29 |16,38 |6,19 |6,29 |3,9 | |30 |24,14 |10,21 |7,24 |6,69 | |31 |16,88 |8,19 |5,3 |3,39 | |32 |19,02 |9,14 |4,9 |4,98 | |33 |19,74 |6,7 |7,16 |5,88 | |34 |22,16 |10,2 |8,12 |3,84 | |35 |16,01 |6,9 |5,49 |3,62 | |36 |13,3 |7,1 |4,2 |2,08 | |37 |19,2 |9,03 |6,59 |3,58 | |(|19,52 |8,96 |6,54 |4,1 | |% |100 |46 |33,5 |20,5 |.

Додаток 2.

Зміст АК, ДАК і ДКГК в еритроцитах дітей, котрі страждають инсулинзависимым цукровий діабет здорових детей.

форма (АК ДКГК ДАК АК.

(АК ДКГК ДАК АК.

АК М (m М (m М (m М (m.

М (m М (m М (m М (m.

З 19.52 8.96(0.9 6.54(0.49 4.1(0.04 12.48(0.5 6.16(1.01 2.2 (0.56 4.28 (0.82.

(0.89.

% 100 46 33.5 20.5 100 49.4 17.6.

Р.