Рентгеноструктурний аналіз білка

У природі зустрічається приблизно 1012 різних білків, що виконують найрізноманітніші функції. Це і білки-ферменти, що каталізують біохімічні процеси в живій клітині; і білки-переносники, що дозволяють іншим молекулам проходити через ядерні або клітинні мембрани або переміщатися між клітинами всього організму; і іммуноглобулярние білки, що відрізняються високою специфічністю взаємодії з антигенами, що призводить до активації сигнальних шляхів, які забезпечують імунну відповідь клітин.

При всьому своєму структурному і функціональному різноманітті всі природні білки побудовані з 20 амінокислот, з'єднаних відповідно з кодом білкового синтезу. Залежно від послідовності амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюзі формується певна стабільна тривимірна структура білка, що визначає його структурні і функціональні властивості.

З’ясування просторової організації білків — один з основних напрямків сучасної біохімії. У багатьох випадках знання структури білка і його комплексу з інгібіторами є вирішальним фактором при створенні лікарських препаратів.

Одним з найважливіших експериментальних методів, що дозволяють з атомарної точністю дізнатися, що являє собою тривимірна структура білка, тобто визначити просторові координати всіх атомів досліджуваного об'єкта, є рентгеноструктурний, або Кристалографічний, аналіз. Знаючи положення кожного атома, можна обчислити міжатомні відстані, валентні кути, кути обертання навколо зв’язків, розподіл поверхневого заряду та інші деталі молекулярної геометрії.

Застосування рентгеноструктурного аналізу для дослідження складно-організованих біологічних об'єктів почалося після 1953, коли співробітник Кавендішськой лабораторії Кембриджського університету Макс Перутц знайшов спосіб визначення структури великих молекул, таких як міоглобін і гемоглобін. З тих пір рентгеноструктурний аналіз молекул білка допомагає нам зрозуміти хімію біологічних реакцій. На сьогоднішній день відомі структури близько 15 тис. Білків та їх комплексів з біологічно важливими молекулами.

Як же ставиться рентгенівський експеримент? Принципова схема проста: досліджуваний об'єкт поміщають в пучок рентгенівських променів і вимірюють інтенсивність розсіяного в різних напрямках випромінювання. Найпростіший спосіб — помістити на шляху пучка променів фотоплівку і за ступенем потемніння плями після прояву судити про інтенсивність розсіювання в цьому напрямку. Звичайно, на сьогоднішній день існують і більш досконалі методи, але зараз це не важливо. В даному випадку важливо те, що ми не дивимося на інтенсивність променів, що пройшли крізь об'єкт, а на інтенсивність променів, що виникли там, де їх начебто і не повинно було бути.

Отже, на вході ми маємо невідомий об'єкт, на виході - набір інтенсивностей розсіяних в різних напрямках променів, або дифракційну картину. Тепер необхідно пов’язати отриману в експерименті інформацію з атомною структурою досліджуваного об'єкта.

Метод рентгеноструктурного аналізу заснований на дифракції рентгенівських променів на кристалічній решітці і тому застосовується лише до речовин в кристалічному стані. Це пов’язано з тим, що для реєстрації дифракційної картини розсіювання необхідно мати достатню кількість розсіюють електронів. Але якщо зразок складається з великої кількості довільно орієнтованих ідентичних молекул (розчин), то картина розсіювання визначатиметься якимись усередненими по всіляких орієнтаціям характеристиками і навряд чи дозволить отримати детальну інформацію про атомну структуру. Інша справа, якщо велика кількість однакових молекул орієнтовані однаково. Таку можливість дають нам кристалічні зразки.

Говорячи простими словами (і не вдаючись у складні математичні формулювання), кристал — це такий зразок досліджуваної речовини, в якому багато (~ 1012) ідентичних молекул знаходяться в однаковій орієнтації та їх центри утворюють правильну тривимірну грати.

Основна особливість структури кожного кристала полягає в тому, що він побудований з регулярно розташованих в просторі окремих атомів або груп атомів. Якщо кожну повторювану структурну одиницю замінити крапкою, або вузлом, то вийде тривимірна кристалічна решітка. Грати можна уявити собі як систему однакових паралелепіпедів. Кожен такий паралелепіпед носить назву «елементарна комірка кристала» і описується шістьма параметрами: довжинами ребер (a, b, c) і кутами між ними (,).

Одна з основних претензій до методу рентгеноструктурного аналізу з самого початку дослідження структур білків — це те, що в житті білки знаходяться в розчині, а при дослідженні ми їх крісталізуємо. Виникає логічне запитання: чи не відбувається принципових спотворень структури молекул білка при кристалізації? Прийнято вважати, що сильних спотворень все-таки не відбувається. Доводи на користь такої позиції наступні.

По-перше, ряд білків зберігають ферментативну активність і закристалізованому стані, тобто структура змінюється не настільки, щоб білок став «непрацездатний».

Ще одне підтвердження: альтернативне визначення структур деяких білків методом двовимірного ядерного магнітного резонансу не дало суттєвих розбіжностей зі структурами, розшифрованими рентгенівськими методами.

Монохроматичне рентгенівське випромінювання, проходячи через кристал, розсіюється в основному на електронних оболонках періодично повторюваних атомів і утворює дифракційну картину, або рентгенограму. Тому експериментальні рентгенівські дані дозволяють судити про особливості розташування електронів в елементарних кристалічних осередках.