Практичні пропозиції. 
Низькотемпературна консервація статевих і ембріональних клітин птиці

• 1. Для поповнення низькотемпературних банків генетичної інформації, необхідної при виконанні досліджень та робіт в галузі біотехнології, генетики, селекції, репродукції, збереження та відновлення рідкісних порід, доцільно використовувати розроблені нами методи кріоконсервування сперми гусаків, півнів та ембріональних клітин курей в облицьованих гранулах та пайєтах, які відрізняються від відомих технічних рішень новизною, високою результативністю, дозволяють маркувати та зберігати зразки без забруднення протягом тривалого періоду (роки, десятиріччя).
• 2. Для визначення життєздатності ембріональних клітин та запліднюючої здатності статевих клітин птиці за 3 — 10 хвилин слід використовувати флуоресцентний метод з вживанням рекомендованих нами флуорохромів, а саме: етідіум броміду, суміші тіазинового червоного та етідіум броміду, a-нафтіламину. консервація нова технологія низькотемпературна

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

• 1. Сахацкий Н. И., Терещенко А. В., Артеменко А. Б. Экспресс-метод оценки оплодотворяющей способности замороженно-оттаянной спермы с.-х. птицы // С.- х. биология. — 1987. — N 12. -С. 77−80. (автором особисто розроблено 50%).
• 2. Сахацкий Н. И., Терещенко А. В., Артеменко А. Б. Усовершенствование способа определения качества спермиев // Птицеводство: Межвед. темат. науч. сб./ УНИИП, 1989. — Вып.42. — С. 23−27. (автором особисто розроблено 50%).
• 3. Артеменко А. Б., Терещенко А. В., Новиков А. Н., Линник Т. П. Криоконсервирование спермы петуха // Птицеводство: Межвед. темат.науч. сб./ УНИИП, 1990. — Вып. 43. — С. 14−17. (автором особисто виконано 50%).
• 4. Сахацкий Н. И., Терещенко А. В., Артеменко А. Б. Технология замораживания спермы петухов // Птицеводство. — 1991. — N 5. — С.10−11. (автором особисто розроблено 50%).
• 5. Терещенко А. В., Артеменко А. Б., Тагиров М. Т., Белецкая А. В., Сахацкий Н. И. Низкотемпературная консервация бластодермальных клеток эмбрионов кур // С.-х. биология. — 1993. — N 6. — C. 53−58. (автором особисто виконано 80%).
• 6. Линник Т. П., Терещенко А. В., Артеменко А. Б Влияние белковых добавок к криозащитной среде на сохранность спермиев петуха при криоконсервировании // Проблемы криобиологии. — 1996. — N 2. — С.35−39. (автором особисто виконано 33%).
• 7. Линник Т. П., Грищенко В. И., Артеменко А. Б., Терещенко А. В. Влияние осмотичности криозащитной среды на сохранность спермиев петуха при криоконсервировании // Проблемы криобиологии. — 2000, — N 2, — С.86−93. (автором особисто виконано 30%).
• 8. Линник Т. П., Грищенко В. И., Артеменко А. Б., Терещенко А. В. Влияние длительного низкотемпературного хранения спермы петухов на ее оплодотворяющую способность // Проблемы криобиологии. — 2000, — N 3, — С.64−71. (автором особисто виконано 50%).
• 9. А.с. 1 329 780 СССР. МКИ А61Д 7/02. Способ определения качества спермиев / Терещенко А. В., Сахацкий Н. И., Артеменко А. Б. — № 4 035 697/30−15; Заявлено 24.03.86; Опубл. 15.08.87; Бюл. N 30. — 3 c. (автором особисто розроблено 50%).
• 10. А.с. 1 475 645 СССР. МКИ А61D 7/02. Способ определения оплодотворяющей способности спермиев / Терещенко А. В., Сахацкий Н. И., Артеменко А. Б. — № 4 241 244/30−15; Заявлено 07.05.87; Опубл. 30.04.89; Бюл. N 16. — 3 c. (автором особисто розроблено 50%).
• 11. А.с. 1 524 882 СССР. МКИ А61D 7/02. Способ криоконсервации спермы птиц / Сахацкий Н. И., Терещенко А. В., Новиков А. Н., Линник Т. П. Артеменко А.Б. — № 4 395 197/30−15; Заявлено 22.03.88; Опубл. 30.11.89; Бюл. № 44. — 4 c. (автором особисто розроблено 40%).
• 12. Sakhatsky N.I., Andreyev V. I, Artemenko A.B. Technology of goose sperm low temperature conservation // 10-th European symp. on waterfowl: Preliminary proc. (march 26−31,1995). —, Halle (Salle), Germany. — 1995. — P.226−228. (автором особисто виконано 50%).

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 — біотехнологія. — Інститут тваринництва УААН, Харків, 2002.

Дослідження виконані в напрямку удосконалення відомих та розробки нових технологій низькотемпературної консервації статевих клітин гусаків та півнів, а також ембріональних клітин курей в облицьованих гранулах та пайєтах. Розроблено технології низькотемпературної консервації сперми гусаків та півнів, що гарантують при їх застосуванні для штучного осіменіння гусей одержання заплідненості яєць на рівні 85,1 — 91,0%, курей — 75 — 85%. Доказана висока ефективність використання флуоресцентного методу для визначення запліднюючої здатності сперми півнів за умовами вживання флуорохромів, що характеризують стан акросом сперматозоїдів, а саме суміші: тіазінового червоного та етідіум броміду або a-нафтіламіну. З використанням цих технології та запасу сперми, що зберігалась в генетичному банку протягом 3 — 9 років, відновлено 3 рідкісних породи курей. Розроблена технологія консервації суспензії ембріональних клітин курей, яка забезпечує збереження життєздатності у 80−90% клітин після їх кріоконсервування, а також флуоресцентний метод визначення їх життєздатності.

Ключові слова: біотехнологія, кріоконсервування, низькотемпературний банк, статеві клітини, ембріональні клітини.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 — биотехнология. — Институт животноводства УААН, Харьков, 2002.

Исследования выполнены в направлении усовершенствования известных и разработки новых технологий низкотемпературной консервации половых клеток гусаков и петухов, а также эмбриональных клеток кур в облицованных гранулах и пайеттах для долговременного хранения в генетических банках и использования в работах в области биотехнологии, генетики, селекции, репродукции, сохранении и восстановлении редких пород. Разработан ряд технических решений, отличающихся новизною и высокой результативностью. В частности, технология низкотемпературной консервации спермы гусаков в облицованных гранулах предусматривает использование защитной среды Б-26 совместно с диметилформамидом в конечной концентрации 10%, ступенчатых режимов охлаждения и размораживания. Это гарантирует при ее применении для осеменения гусей получение оплодотворенности яиц на уровне 85,1 — 91,0%, вывода гусят 66,3 — 72,9%.

Доказана высокая эффективность использования флуоресцентного метода для определения оплодотворяющей способности спермы петухов при условии применения флуорохромов, характеризующих состояние акросом сперматозоидов, а именно, смеси тиазинового красного с этидиум бромидом или a-нафтиламина. Разработана технология низкотемпературного консервирования спермы петухов в пайеттах, которая предполагает использование защитной среды С-2 в соединении с диметилформамидом в конечной концентрации 7%, ступенчатых режимов ее разбавления и охлаждения, некоторых других приемов, которые обеспечивают получение при осеменении кур оплодотворенности яиц 75−85%, вывода цыплят 70−75%. При этом были определены температурные зоны, в которых при охлаждении с линейными скоростями, спермии получают максимальные повреждения. Использованный для разрапботки защитной среды план Плакетта-Бауэра позволил определить, что компоненты по разному влияют на показатели качества сперматозоидов. Это позволило выделить компоненты защитной среды, способствующие сохранению половыми клетками способности к оплодотворению. Был оптимизирован состав защитной среды и ее осмотическое давление.

С использованием этой технологии и запаса спермы, хранившегося в генетическом банке на протяжении 3 — 9 лет, восстановлены три редкие породы кур (голошейные, падуан, украинские ушанки), которые переданы для дальнейшего размножения и использования в коллекционное стадо.

Экспериментально обоснована возможность низкотемпературного консервирования суспензии эмбриональных клеток кур. Разработана технология, обеспечивающая сохранение жизнеспособности у 80 — 90% эмбриональных клеток после их криоконсервирования в пайеттах под защитой диметилформамида в фосфатно-солевом буфере при условии его ступенчатого ввода при температуре 20 °C до конечной концентрации 10% и при охлаждении со скоростью 1°С/мин до -30°С с последующим погружением в жидкий азот, а также флуоресцентный метод определения их жизнеспособности.

Dissertation on completion of the scientific degree of the candidate of agricultural sciences on the speciality 03.00.20 — biotechnology. — Institute of Animal Science of UAAS, Kharkiv, 2002.

The investigations are devoted to the improvement of well-known technologies and to development of new ones on low-temperature conservation of geese and cocks sexual cells and embryonal chicken cells in caated granules and straws. The technology of low-temperature conservation of cock and geese semen that guarantees egg fertility at the level of 85,1−91% while its usage for geese insemination and 75−85% while its usage for chicken insemination is devised. The high efficiency of application of the fluorescent method for determination of fertilization capacity of cock semen under condition of usage of fluorochromes, which characterize the state of acrosomes (mixture of tiazol red and ethidium bromide or a-naphthylamine), is proved. Using this technology and the supply of semen, kept in the genetic bank for 3−9 years, three rare strains of chickens are restored. The technology of conservation of embryonal chicken cell suspension that ensure preservation of viability at the level of 80−90% after their cryoconservation, and fluorescent method of determination of their viability are also devised.

Key words: biotechnology, cryoconservation, low-temperature bank, sexual cells, embryonal cells.