Проведення полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі

RT-ПЦР проводилось на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), краситель, применяемый в работе — SYBR Green. В качестве праймеров, подобранных с помощью программного обеспечения Primer3, использовали нуклеотидные последовательности:

к гену fum 1:

прямой — 5' -gattacttcgatcattgaggt-3'.

обратный 5' -accagaactcgcggatgtggc-3'.

к гену fum 2:

прямой — 5'-acaaacttgccattcgtcacc-3';

обратный — 5'-tggttcattctcaggcagaga-3'.

Параметры проводимой амплификации: денатурация 95^оС — 5 мин., после чего цикл: 95^оС — 30 сек., 60^оС — 30 сек., 72^оС — 30 сек. (детекция), финальная элонгация — 72^оС — 10 мин. Количество кДНК контролировалось с использованием параллельной амплификации фактора элонгации ef-1б и разработанными нами ген-специфичными праймерами. Отрицательным контролем служила суммарная РНК не подвергшаяся обратной транскрипции.

Относительный уровень экспрессии исследуемых генов определялся при помощи 2^-ДДCt-метода и программного обеспечения Opticon Monitor^TM Software (Biorad, США).

Статистическая обработка данных

Каждый опыт проводился в 3−4 кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. На рисунках приводятся данные опытов, каждое значение есть среднее из трех измерений. Полученные данные обрабатывали с использованием статистических критериев. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0,05 [4].