Оптимізація складу живильного середовища для Pseudomonas maltophilia ОNU329 сорбента йонів важких металів та деструктора вуглеводнів нафти

Оптимізація складу живильного середовища для Pseudomonas maltophilia ОNU329 сорбента йонів важких металів та деструктора вуглеводнів нафти

На сьогоднішній день в більшості країн світу із усіх відомих методів очистки води та ґрунту від широкого спектру забруднювачів йонів важких металів, нафтопродуктів, синтетичних поверхнево-активних речовин, віддають перевагу біологічним методам, які порівняно з механічними, фізичними та хімічними методами є більш ефективними, універсальними і екологічно безпечними за рахунок використання активних непатогенних мікроорганізмів [11, 12].

Перспективним для створення нового ефективного поліфункціонального біопрепарату, призначеного для очистки навколишнього середовища від полютантів, є штам Pseudomonas maltophilia ONU329 сорбент йонів важких металів [3], деструктор вуглеводнів нафти [4], продуцент біосурфактантів екзогенного типу [5, 6].

Для зменшення часу і витрат, пов’язаних із накопиченням біомаси бактерій, біопрепарат готують у підібраному оптимізованому живильному середовищі у рідинній формі, за спеціальною технологією бактерії іммобілізують на суміші природних сорбентів [9].

При доборі живильних середовищ та оптимізації умов культивування з метою підвищення виходу біомаси широко застосовують методи математичного планування експерименту [2, 8]. Вони дозволяють не тільки одночасно дослідити дію декількох факторів на процес, а й кількісно оцінити ступінь цього впливу.

Метою наших досліджень була оптимізація складу живильного середовища (ЖС) і умов культивування бактерій Pseudomonas maltophilia ONU329 сорбентів іонів важких металів та деструкторів вуглеводнів нафти, для отримання максимальної кількості біомаси бактерій.

Матеріали і методи

В роботі використовували штам Pseudomonas maltophilia ONU329, ізольований із забрудненого нафтопродуктами морського середовища. Культивування здійснювали на шейкері-інкубаторі New Brunswick Scientific Incubator Shaker INNOVA 43R у флаконах зі 100 мл середовища при 150 об/хв протягом 48 год при 29,0 °С. Засів живильного середовища проводили добовою культурою, що виросла на м’ясо-пептонному бульйоні (МПБ) у стаціонарних умовах за температурі 30,0 °С. Об'єм посівного матеріалу складав 1,0% до об'єму середовища.

Оптимізацію проводили за допомогою методу ортогональних латинських квадратів [1]. Приріст біомаси бактерій визначали за зміною показника оптичної щільності на спектрофотометрі Specol-10 (Perkin Elmer USA) за довжини хвилі 540 нм. Титр клітин визначали методом серійних розведень з подальшим висівом на щільне середовище МПА [2]. Визначення питомої швидкості росту проводили за стандартними методиками [7, 10].

Математичну обробку експериментальних даних проводили шляхом розрахунку ефектів впливу на показники оптимізації на усіх рівнях досліджених факторів [1]. Результати обробляли статистично.

Біотехнологія очищення води від йонів важких металів передбачає використання іммобілізованих у складі біофлоків бактерій. Суть утворення біофлоків полягає в тому, що під дією перекису водню і хлориду кальцію в однорідній суспензії бактерій утворюються біофлоки. При цьому різко збільшується загальна адсорбційна ємність системи і, відповідно, ефективність очищення води від йонів важких металів.

Для оцінки ефективності використання отриманого біопрепарату у біотехнології очистки води від йонів важких металів використовували сульфат цинку.

Модельний розчин солі цинку з концентрацією 40 мг/л по металу [C0(Zn2+) = 40 мг/л] готували розчиненням у 1 л води 176 мг солі ZnSO4*7H2O. Бактерії Pseudomonas maltophilia ONU329 нарощували на досліджуваних живильних середовищах. До 15 мл модельного розчину сульфату цинку з вихідною концентрацією по металу 40 мг/л додавали 15 мл суспензії бактерій роду P maltophilia ONU329 у концентрації 10*108 клітин/мл та флокулянти (10−6 моль/л перекису водню і 0,046 моль/л хлориду кальцію), інтенсивно перемішували впродовж 60 хв на шутелі та 15 хв відстоювали. Після відстоювання і центрифугування проб надосадові розчини аналізували на залишковий вміст у них йонів цинку атомно-абсорбційним методом на полум’яному атомно-абсорбційному спектрофотометрі «Сатурн» у полум'ї суміші «повітря пропан бутан». Кількість біофлоків після відстоювання оцінювали за їх об'ємною часткою (об%) відносно 100 мл живильного середовища [13]. Експерименти здійснювали в п’яти повторах. Результати дослідження опрацьовували статистично з використанням програми і «Microsoft Office Ехсеї 2003».

Результати досліджень та їх обговорення

З метою оптимізації умов культивування, отримання максимальної кількості біомаси бактерій і біофлоків, досліджували вплив на інтенсивність росту бактерій Pseudomonas maltophilia ONU-329 джерел азоту, вуглецю та співвідношення вуглецю до азоту в середовищі.

Живильні середовища для культивування бактерій містили у своєму складі усі необхідні для росту компоненти. Мінеральна складова середовищ включала неорганічні джерела азоту (NH4Cl) та фосфору (KH2PO4 і Na2HPO4).

Як органічну складову живильних середовищ використовували витяжку з торфу, сірчанокислотний гідролізат рибокісткового борошна та комбінацію пептону, дріжджового екстракту та глюкози. Виходячи з економічної доцільності, здешевлення вартості готової біомаси, середовище 3 містило у два рази менше фосфорних солей та у 5 разів менше глюкози, ніж середовища 1 і 2.

Склад середовищ, використаних у досліді, наведено у таблиці 1. Рівень рН кожного з середовищ був 7,2 і залишався незмінним впродовж культивування.

Під час дослідження також перевіряли вплив дистильованої та водогінної води, що використовували для приготування живильних середовищ, на ростові характеристики штаму P maltophilia ONU-329.

При використанні дистильованої води за результатами дослідження було показано, що при культивуванні штаму P maltophilia ONU-329 на середовищах різного складу бактерії виявили неоднакову ростову активність.

На середовищі 3, яке містило такі органічні сполуки як пептон і глюкоза, спостерігали найбільш інтенсивний ріст штаму P maltophilia ONU-329 (табл. 1). Максимальні показники оптичної щільності на цьому середовищі досягали значення 2,2 D. Чисельність клітин на момент виходу культури на стадію стаціонарного росту досягала значення (42,0±9,93)*108 КУО/мл. Показник питомої швидкості росту штаму P maltophilia ONU-329 на середовищі 3 склав 0,19 год-1.

Таблиця 1 Склад живильних середовищ (г/л).

Також високі показники чисельності клітин P maltophilia ОNU329 (23,0±4,96)*108 КУО/мл спостерігали на середовищі 2, яке містило глюкозу та сірчанокислотний гідролізат рибокісткового борошна. Показник оптичної щільності на цьому середовищі був дещо меншим і досягав значення 1,9 D. При цьому показник питомої швидкості росту штаму на цьому середовищі був максимальним 0,29 год-1.

На живильному середовищі 1, яке містило витяжку з торфу в кількості 10,0 г/л і глюкозу в кількості 10 мг/л, відзначався невисокий приріст біомаси бактерій P maltophilia ONU-329, і на перші 48 годин культивування оптична щільність суспензії клітин не перевищувала 1,0 D. Кількість життєздатних клітин також була суттєво меншою (36,0±9,93)*107 КУО/мл. Значення питомої швидкості росту штаму P maltophilia ONU-329 при використанні середовища 3 також було мінімальним 0,105 год-1.

Проведений однофакторний дисперсійний аналіз статистично підтвердив існування вірогідного розходження між показниками, що перевіряли. Достовірність підтверджена за допомогою порівняння табличного і розрахованих значень критерію Фішера. У наших випадках дотримується нерівність ^табл<^факт і визнається статистична значимість різниці між середніми значеннями: Ft (3,4)<�Бф (21,4) для показника оптичної щільності, та для показника КУО/мл (3,4)<�факт (81,4).

У другій серії дослідів використовували водогінну воду для приготування живильних середовищ. Було показано, що якість води, яку використовували, суттєво не впливає на динаміку росту штаму P maltophilia ONU-329. Результати дослідження наведені у таблиці 2.

Таблиця 2 Показники оптичної щільності штаму Pseudomonas maltophilia ONU-329 залежно від якості води.

Отримані дані підтверджені результатами однофакторного дисперсійного аналізу: за розрахованими статистичними показниками Fij]Јun, = 0,33 у порівнянні з Ftab = 3,4. Таким чином, приймається нульова гіпотеза, яка свідчить про рівність середніх значень для обох вибірок.

Враховуючи, що і вихід біомаси при культивуванні на водогінній і дистильованій воді практично не відрізнялися між собою, у промислових умовах, виходячи з економічної доцільності, можна використовувати середовища, приготовлені на водогінній воді.

На другому етапі проводили оптимізацію складу живильного середовища для культивування бактерій за допомогою багатофакторного експерименту за методом ортогональних латинських квадратів з подальшою математичною обробкою отриманих даних. Матрицю планування складали за схемою 3;3k яка дозволяла вивчити в умовах одного експерименту взаємний вплив на ріст культури трьох факторів на трьох рівнях. Облік результатів проводили через 24 години культивування.

Як фактори оптимізації використовували пептон, глюкозу та джерело мінерального фосфору у вигляді суміші солей KH2PO4 і Na2HPO4.

У експерименті використовували досліджені чинники у кількості:

• • пептон 10,0 г/л, 15,0 г/л, 20,0 г/л (крок 5,0 г/л);
• • глюкоза 2,0 г/л, 6,0 г/л, 10,0 г/л (крок 4,0 г/л);
• • фосфати (KH2PO4 і Na2HPO4) 1,5 г/л: 3,0 г/л; 3,0 г/л: 6,0 г/л; 4,5 г/л:
  • 9,0 г/л (крок 1,5 г/л та 3,0 г/л).

У таблиці 3 наведені концентрації чинників, які брали у дослід з усіма можливими комбінаціями та показники параметрів оптимізації. В результаті отриманих даних були обчислені ефекти впливу усіх чинників на рівнях, які наведені у табл. 4.

Було з’ясовано, що максимальні ефекти впливу глюкози отриманні за використання концентрації 2,0 г/л. Максимальні ефекти впливу пептону зареєстровані за мінімальної концентрації цього компоненту у живильному середовищі (10,0 г/л). Максимальні ефекти впливу фосфатів відповідають їх концентрації у співвідношенні 1,5 г/л: 3,0 г/л для KH2PO4: Na2HPO4, відповідно.

За вказаних комбінацій компонентів живильних середовищ показник оптичної щільності досягав значення 1,75 D, кількість клітин була максимальною і досягала значення (96,6±18,57)х108 КУО/мл.

Таблиця 3 Концентрації компонентів живильних середовищ (г/л), які використали у експерименті та показники оптимізації.

Таблиця 4 Ефекти впливу компонентів живильних середовищ та їх концентрацій на показники оптимізації.

Тобто, оптимальне співвідношення вуглець: азот варіювало від 1:4 до 1:5. Отримані дані можна вважати оптимальними для росту культури.

За результатами першого етапу оптимізації середовище має склад (г/л): KH^O4 1,5, Na2HPO4 3,0, NaCl 5,0, NH4Cl 1,0, пептон 10,0, глюкоза 2,0.

З метою подальшого підвищення продуктивності штаму Pseudomonas maltophilia ONU329 були проведені експерименти з вивчення впливу дріжджового екстракту на динаміку росту бактерій на живильному середовищі, що містить пептон (10,0 г/л) і глюкозу (2,0 г/л). Отримані результати наведені у таблиці 5.

Як бачимо з наведених у таблиці 5 даних, найкращі результати були отриманні при додаванні до середовища дріжджового екстракту у концентрації 5,0 г/л.

Таким чином, після завершення оптимізації з використанням методу ортогональних латинських квадратів та подальшим додатковим визначенням необхідної концентрації дріжджового екстракту, визначили остаточний склад живильного середовища для культивування Pseudomonas maltophilia ONU329 наступний (г/л): KH2PO4 1,5, Na2HPO4 3,0, NaCl 5,0, NH4Cl 1,0, пептон 10,0, глюкоза 2,0, дріжджовий екстракт 5,0.

Заключним етапом нашої роботи було вивчення впливу складу оптимізованого живильного середовища для культивування Pseudomonas maltophilia ONU329 на кількість біофлоків, що утворюються в процесі вилучення важких металів з розчинів із застосуванням мікробної біотехнології. Результати досліджень наведені на рис. 1.

Таблиця 5 Вплив дріжджового екстракту на динаміку росту штаму Pseudomonas maltophilia ONU329.

Як видно з наведених даних, кількість біофлоків, що утворюються в процесі очищення розчинів від важких металів, значною мірою залежить від складу живильного середовища, на якому культивували бактерії Pseudomonas maltophilia О№и-329. Максимальна кількість біофлоків (23,0 ±1,0 об.% та 25,0 ±2,0 об.%) утворювалася на середовищах 3 та оптимізованому.

Хімічний аналіз показав, що ступінь вилучення йонів Zn (II) на середовищі 3 та оптимізованому сягала 98,9±8,77% і 99,9 ± 5,41%, у той час як на середовищах 1 і 2 не перевищувала 50,8±6,36% і 56,1 ± 4,11% (рис. 2) [13].

Рис. 1. Вплив складу живильного середовища для культивування Pseudomonas maltophilia О№С329 на обсяг біофлоків, що утворюються в процесі вилучення важких металів

Рис. 2 Ступінь вилучення йонів цинку іммобілізованими клітинами Pseudomonas maltophilia ОNU329, культивованими на живильних середовищах різного складу

Підсумовуючи отримані дані, можна рекомендувати для накопичення максимальної кількості біомаси P maltophilia GNU-329 і отримання великої кількості біофлоків в процесі очищення розчинів від йонів важких металів, такі умови культивування бактерій: склад живильного середовища: NaCl 5,0 г/л; NH4Cl 1,0 г/л; KH2PO4 1,5 г/л; Na2HPO4 3,0 г/л; пептон 10,0 г/л; глюкоза 2,0 г/л; дріжджовий екстракт 5,0 г/л, вода дистильована або водопровідна 1 л; рН = 7,2; температура культивування 29 °C.

Список використаної літератури

• 1. Бирюков В. В., Кантере В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.: Наука, 1985. 296 с.
• 2. Васильєва Н.Ю., Гудзенко Т. В., Панченко М. М., Іваниця В. О. Оптимізація складу поживного середовища для ентомопатогенних бактерій штаму Bacillus thuringiensis ОНУ 15 // Мікробіологія і біотехнологія. 2012. № 4(20). C. 52−63.
• 3. Гудзенко Т. В., Волювач О. В., Бєляєва Т.О., Конуп І.П., Бухтіяров А.Є., Захарія О.М., Лісютин Г. В., Горшкова О. Г., Іваниця В. О. Вилучення міді (II) та нікелю (II) із концентрованих водних розчинів глиною, хітозаном та іммобілізованими мікроорганізмами // Мікробіологія і біотехнологія. 2012. № 4. С. 36−43.
• 4. Гудзенко Т. В., Волювач О. В., Бєляєва Т.О., ЛісютінГ.В., Горшкова О. Г., Іваниця В. О. Нафтоокиснювальна активність деяких штамів бактерій роду Pseudomonas // Мікробіологія і біотехнологія. 2013. № 4. С. 72−80.
• 5. Гудзенко Т. В., ІваницяВ.О., Волювач О. В., Горшкова О. Г., Бєляєва Т.О., Конуп І.П., ДімоваМ.І. Вплив поживного середовища на здатність нафтоокиснювальних бактерій роду Pseudomonas продукувати біосурфактанти // Scientific Journal «ScienceRise» 2014, № 5/1(5). С. 7−11.
• 6. Гудзенко Т. В., Горшкова О. Г., Бєляєва Т.О., Ракітська С.І., ЛісютінГ.В., Іваниця В.О. Біотехнологія оздоровлення морського середовища з використанням іммобілізованих мікроорганізмів / Наукові записки Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка. Серія. Біологія 2015, № 3−4 (64). С. 146−149.
• 7. Ждан-Пушкина С. М. Основы роста культур микроорганизмов: Учеб. пособие / Под ред. В. П. Гончаровой.— Л.: Лен. ун-т, 1983. — 188 с.
• 8. Максимов В. Н., Пименова М. Н., Гречушкина Н. Н. Оптимизация состава питательной среды методом планирования эксперимента // Практикум по микробиологии. М., 1976. С. 172−181.
• 9. Нгуен Виет Тиен. Гетеротрофные бактерии техногенных субстратов как основа биопрепаратов-деструкторов нефтяных углеводородов и поверхностноактивных веществ: Автореф. дис.. .канд. биол. наук. Ульяновск, 2013. 174 с.
• 10. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Наука, 1978. 333 с.
• 11. Mougin C., Boukcim H., Jolivalt C. Advances in Applied Bioremediation (Soil Biology). Berlin, Heidelberg: Springer Verlag. 2009. 17. P 123−149.
• 12. Obayori O.S., Ilori M.O., Obayori O. S., Adebusoye S. A, Oyetibo G.O., OmotayoA.E. Amund Degradation of hydrocarbons and biosurfactant production by Pseudomonas sp. strain LP1 // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2009. 25, № 9. P 1615−1623.
• 13. Патент України № 90 119, МПК C02 °F 1/24. Спосіб мікробіологічного очищення води від іонів цинку / Іваниця В.О., Гудзенко Ш. В., Волювач О. В., Горшкова О. Г, Бєляєва Ш. О., Конуп І.П., Баранов О. О. (Україна). N 90 119; заявл. 24.12.2013; опубл. 12.05.2014, Бюл. N 9.