Математическое моделювання біосинтезу продуктів метаболизма

МЕТАБОЛІЗМ — грецьке слово metabole, що означає зміна, перетворення.

У фізіологічному сенсі метаболізм — це проміжний обмін, т. е. перетворення певних речовин всередині клітин із моменту їхнє надходження до освіти кінцевих продуктів (напр., метаболізм білків, метаболізм глюкози, метаболізм лікарських препаратов).

З погляду промислової біотехнології метаболізм — це особливе утворення у процесі росту та розвитку клітин цінних біохімічних продуктів — окремі виділяються у середу (внеклеточные продукти), деякі накопичуються в біомасу (внутрішньоклітинні продукти). З допомогою метаболізму отримують антибіотики, молочну і лимонну кислоту, харчові консерванти і ще продукты.

У природничих умовах метаболізм налаштований те щоб виробляти мінімум необхідних метаболітів. Промислового виробництва, спрямоване отримання максимального прибутку, що ситуація неможливо влаштовує. Тому, для максимізації прибутку необхідно зробити оптимізацію наступних технологічних параметров:

— виходу продукту розрахунку спожитий субстрат;

— концентрація продукта;

— швидкість освіти продукта.

Оптимізація технології біосинтезу метаболітів складається з таких основних етапів [5]:

1) Початкова селекція штами микроорганизмов;

2) Визначення оптимальних значень температури, рН, тонічності й потреби в кислороде;

3) Визначення оптимального режиму харчування та накопичення грошових биомассы;

4) Зміна генетичної структури організму збільшення освіти продукта.

Розробка 3-его етапу, безпосередньо з біосинтезом. Для перебування режиму харчування та накопичення грошових біомаси, оптимального для біосинтезу метаболітів необхідно математичне опис процесу [1,2,3,4]. Крім перебування оптимальних умов проведення процесу, математична модель використовується для автоматизації біосинтезу, що у сучасної біотехнологічній промисловості щонайменше важно.

Перш ніж приступити, до опису моделей наведемо прийняті позначення основних кількісних характеристик процесу биосинтеза.

Кінетичні характеристики процесу биосинтеза.

Зазвичай стан процесу визначається такими основними параметрами:

— концентрація біомаси мікроорганізмів — Х, г/л;

— концентрація живильне середовище — субстрату (або його основного компонента) — P. S, г/л.

— концентрація продукту — P, г/л.

Кінетичні характеристики процесу відбивають швидкість перебігу біохімічних перетворень. Ці перетворення, природно, б’ють по всіх зазначених вище параметрах процесу — біомасу, продукт і субстрате.

Важливими показниками процесу є швидкість зростання біомаси. Для описи швидкості зростання використовується така характеристика, як загальна швидкість зростання — QX:

(1).

Більший інтерес для характеристики інтенсивності зростання представляє не величина QX, а питома швидкість зростання перерахунку одиницю біомаси (адже зростання біомаси пропорційний концентрації клітин). Вона позначається буквою ?:

(2).

Розмірність величини? — [1/ч].

Розглянемо тепер другий параметр процесу ферментації - концентрацію субстрату P. S. За аналогією зі зростанням біомаси, можна запровадити кінетичну характеристику — швидкість споживання субстрату QS:

(3).

Знак ‘-‘ позначає, що швидкість споживання позитивна, коли концентрація субстрату серед падає (тобто. швидкість зміни концентрації отрицательна).

Аналогічно, питома швидкість споживання субстрату, яку позначимо малої буквою qS, равна:

(4).

При біосинтезі метаболітів, водночас із зростанням біомаси, відбувається накопичення серед продукту метаболізму (його поточна концентрація — Р).

Загальна швидкість біосинтезу продукту метаболізму QР в періодичному процесі равна:

(5).

Питома швидкість біосинтезу продукту одиницею біомаси позначається qР і равна:

(6).

Для математичного описи біосинтезу продуктів метаболізму різними дослідниками запропонували багато різних моделей. Всі ці моделі можна розділити ми такі группы:

1) Математичні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму як функція від удільної швидкості роста;

2) Субстрат-зависимые моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболизма;

3) Моделі, засновані на концепції віку культури мікроорганізмів .

Під час біосинтезу відбувається також процес зменшення кількості метаболітів, для цього феномена було запропоновано моделі деградації (інактивації) продуктів метаболизма.

Математичні моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболізму як функції від удільної швидкості роста.

Математичний параметр — питома швидкість зростання? — послужив основою складання багатьох математичних моделей біосинтезу продуктів метаболізму. Процеси біосинтезу продуктів здавна ділять великих класу — пов’язані зі зростанням і пов’язані зі зростанням. Як приклад першого класу може бути біосинтез конститутивних ферментів клітини, а другого класу — біосинтез багатьох антибіотиків, інтенсивний синтез яких після припинення зростання микроорганизмов.

Питома швидкість біосинтезу що з зростанням продуктів має простим співвідношенням [5]:

(7),.

де YP/X — вихід одиниці продукту з одиниці біомаси: (dP/dX).

Більше складне вираз запропонували Людекингом і Пайри [6]:

(8),.

де qP0 — емпірична константа.

І тут біосинтез продукту, з одного боку, асоційований зі зростанням, з другого, здійснюється яка покоїться клітиною [7]. Модель (8) уперше було запропонована для описи синтезу молочної кислоты.

Є низка рівнянь, які враховують нелінійний характер зв’язку qP і удільної швидкості роста:

(9),.

(10),.

де й у — емпіричні константи.

Рис. 1. Форма залежності qР (?) для рівнянь (9) і (10).

На рис. 1 показані графіки функцій (9) і (10), ці рівняння дають опуклу (9) і увігнуту (10) криві, що виходять із нуля, але це функції може мати також додатковий вільний член qP0:

(11),.

(12).

Тоді графіки функцій (11) і (12) на відміну від (9) і (10) виходять ні з нуля, та якщо з деякою точки qP0 на осі y, що продемонстровано на рис. 2.

Рис. 2. Форма залежності qР (?) для рівнянь (11) і (12).

Можливі також емпіричні рівняння типу [8,9]:

(13), (14).

де а, b, з — емпіричні константы.

Рис. 2. Форма залежності qР (?) для рівнянь (13) і (14).

За аналогією з рівняннями (11) і (12) рівняння (14) починається, ні з 0 по осі ординат, та якщо з деякою точки a, що означає початок синтезу продукту без зростання биомассы.

Субстрат-зависимые моделі кінетики біосинтезу продуктів метаболизма.

З погляду математики, рівняння, яких у ролі аргументу виступає ?, припускають, що неважливо, як формується ту чи іншу значення ?. Наприклад, величину? можна змінювати шляхом зменшення концентрації вуглецевого субстрату чи азотного субстрату, чи за методом зниження температури або підвищення величини рН. Для процесів, пов’язаних тільки з зростанням, можливо швидкість біосинтезу цьому буде однакова. Для незв’язаних зі зростанням процесів небайдуже, яким шляхом ми змінювати величину ?. Лімітування вуглецем, лімітування азотом, підвищення рН чи зниження температури, даючи один і той ж значення швидкості зростання, можуть надавати зовсім різні швидкості біосинтезу продукту метаболізму. Інакше кажучи, зв’язок між qP і? немає суворо причинно-наслідкового характеру, а обумовлена впливом на обидві ці кінетичні характеристики одним і тієї ж чинників довкілля. Для таких процесів необхідно використовувати рівняння, що як аргументів містять незалежно впливають первинні чинники: концентрація тієї чи іншої субстрату, температура чи величина рН.

Біосинтез продукту може описуватися однофакторными чи багатофакторними рівняннями. З іншого боку, було встановлено, що структури залежностей qP від P. S, P, температури і величини рН аналогічні структурам так само рівнянь на шляху зростання біомаси, наприклад: Моно, Андрюса, Перта, Хиншельвуда тощо. Наприклад, якщо субстрат впливає qP по Андрюсу, тут маємо [10]:

(15),.

де qm — максимальна питома швидкість біосинтезу продукта;

K’S — константа насыщения;

Ki — константа ингибирования продуктом.

Багатофакторні залежності тут частіше бувають мультипликативными, ніж аддитивными. Наведемо залежність мультиплікативного [11] і аддитивного впливу концентрації субстрату за механізмом Моно:

(16),.

(17).

Застосовуються також рівняння з не роздільними ефектами чинників, наприклад, типу Контуа [10] чи неконкурентного гальмування продуктом [5]:

(18),.

(19).

На жаль, неможливо викласти все кінетичні залежності біосинтезу продуктів від первинних чинників у такому короткій роботі. Цей матеріал докладно викладений у монографії [14], у якій подано як кілька десятків рівнянь, а й зроблено їх науковий аналіз.

Моделі, засновані на концепції віку культури микроорганизмов.

Для біосинтезу продуктів метаболізму це часто буває недостатньо лише сприятливих «зовнішніх» чинників середовища. Тому що на біосинтезі беруть участь внутрішньоклітинні ферменти мікроорганізмів, проміжні продукти, зміст що у клітині залежить від передісторії розвитку. Занадто швидко зросла культура часто неефективна з погляду біосинтезу продукту. У мікробіологів є вираз «культура і у бадилля», що означає біомаси — багато, продукту — мало чи взагалі немає. Проте, враховувати ці внутрішньоклітинні компоненти під час моделювання дуже проблемно — їх важко вимірювати і знаходити кінетичні коэффициенты.

Натомість запропоновані деякі феноменологічні підходи для оцінювання фізіологічного стану мікробної біомаси, засновані оцінці вікового стану популяції клеток.

Є кілька підходів для обліку віку культури. Одне з них залежить від визначенні розподілу клітин мікроорганізмів по віком [12]. Тоді значення удільної швидкості біосинтезу продукту вважатимуться хіба що сумою швидкостей, які дають різними віковими фракціями биомассы:

(20),.

де ?Xi — концентрація біомаси i-ой вікової группы;

qi — питома швидкість біосинтезу біомасою i-ой вікової группы.

У цьому, цілком імовірно, що значення q1, q2, …, qn ні однаковими: «молодь» не синтезує потрібний продукт, занадто старі клітини — тоже.

Японським ученим Аибой було запропоновано простіший підхід, використовуватиме оцінки віку культури так званий середній вік популяції як параметр, визначальний биосинтетическую активність культури [13]. Біологічно термін цілком зрозуміла — це сума вікових груп всіх клітин, поділена з їхньої количество:

(21),.

де ?і - вік i-ой вікової группы.

Якщо послідовно зменшувати поддиапазоны? t і ??, довівши їх до нескінченно малих dX і dt, то тут для середнього віку можна отримати роботу інтегральну формулу:

(22),.

де Х0 — початкова концентрація биомассы;

— середній вік культури у початковий момент культивирования.

Іншим способом спрощення вікової залежності є поділ вікового діапазону клітин на 2 класу — продуктивний (вище деякого значення) і продуктивний [14]:

(24),.

де ?* - вік зрелости;

qP* - питома швидкість біосинтезу клітини, після досягнення нею віку зрелости.

Тепер залишається розглянути форму залежності удільної швидкості біосинтезу продукту qР від середнього віку культури: .

Якщо залежність має зростаючий характер з насиченням, то залежність зручно висловити у вигляді, схожій рівняння Моно:

(25).

Якщо, навпаки, вона зменшується з віком, то більше вираз, подібне рівнянню Иерусалимского:

(26).

Якщо залежність має екстремум, воно має, наприклад, з допомогою аппроксимирующего полиномиального рівняння [15]:

(27).

Однозначна залежність між qР і практично зустрічається рідко, часто залежність швидкості біосинтезу продукту від його віку враховують як мультиплікативного сомножителя, сполученого провідною частиною рівняння, враховує впливу інших факторов.

Моделі деградації (інактивації) продуктів метаболизма.

Не завжди синтезовані продукти метаболізму залишаються стійкими; часто вони настільки нестабільні, що руйнуються в процесі самої ферментації. Тому, описуючи матеріальний баланс по продукту метаболізму, необхідно враховувати кінетику його инактивации:

(28),.

де — швидкість деградації продукту метаболизма.

Зблизька синтезу метаболітів, використовувалася питома швидкість, у разі деградації, вводити питому швидкість некоректно, т.к. продукт існує осібно від біомаси, та її деградація залежною у випадку від неї концентрации.

Розглянемо моделі кінетики деградации:

(29),.

деградація отсутствует.

(30),.

деградація йде із постійною швидкістю. Такий вираз дивно виглядає у початок процесу, коли продукту ще немає; з рівняння виходить, що концентрація продукту знижується нижче нуля, що ні має фізичного смысла.

(31),.

реакція розкладання першого порядку, пропорційно кількості що утворився продукту [16].

(32),.

реакція розкладання n-ого порядку, до чого n може бути як більше 1, і менше (і же не бути цілим числом.

(33),.

реакція розкладання залежить тільки від концентрації продукту, а й від концентрації биомассы.

(34),.

швидкість реакції розкладання залежить від концентрації біомаси зростає з концентрацією продукту до предела.

Наведені рівняння інактивації (29)-(34) найпоширеніші, є і інші складніші зависимости.

Модель накопичення продукту метаболізму з прикладу лейцина.

L-лейциннезамінна амінокислота, необхідна для промислового отримання лізину. Виробництво лізину виходить з лейцинозависимых штами. Річне виробництво лізину становить приблизно 500 000 т/г. Лізин широко використовують у с/г як кормової добавки. Лейцин також застосовується у спортивному харчуванні, т.к. є попередником незамінних жирних кислот, входять до складу клітинних мембран.

Елементна формула L-лейцина (L-?-аминоизокапроновая кислота): C5H10NH2COOH.

Основним способом виробництва L-лейцина є мікробіологічний синтез з допомогою штами Corynebacterium glutamicum. Біосинтез проводився на лабораторному биореакторе. У отбираемых пробах визначалася оптична щільність — Х, зміст лейцину — P і змістом редуцирующих речовин (РМ) по Бертрану — S.

Отримані результати наводяться в таблиці 1.

Таблиця 1.

Найпростішим припущенням про механізм мікробіологічного биосинтетического процесу є узагальнення даних у тому, що біосинтез, з одного боку, асоційований зі зростанням, з другого, здійснюється яка покоїться клеткой.

Отож і вирішили використовувати таке співвідношення (8):

(35),.

де P — концентрація продукту (лейцину), г/л;

aP, bP — емпіричні константы.

aP, bP було визначено методом найменших квадратів: aP=13.27, bP=1.249, сума квадратів відхилень QP становила 0,884, сама ж середня квадратична помилка SP дорівнює ± 0.6648.

На рис. 3 показані експериментальні значення концентрації лейцину і модельні, з малюнка видно, що модель (8) у разі досить добре описує біосинтез продуктів метаболизма.

Рис. 2. Графічна інтерпретація моделі біосинтезу лейцину (35).

1. Арзамасцев А. А., Андрєєв А. А Математичні моделі кінетики мікробного синтезу: можливості використання коштів і нові підходи до розробки // Вестн. Тамб. ун-ту. Серія: Естеств. і техн. науки.- 2000.- т.V., № 1- з. 111−130.

2. Renss M. Моделювання і оптимізація процесів // 8th Int. Biotechnol. Symp., Paris- 1988.- vol. 1.- p. 523−536.

3. Zeng An-Ping Кінетична модель отримання продуктів мікробних клітин та клітин ссавців // Biotechnol. and Bioeng.- 1994.- vol. 45., N 4.- p. 314−324.

4. Vanrolleghem P.A. Структурний підхід для вибору серед кандидатів до модель схеми метаболізму встановлення невідомих стехиометрических коефіцієнтів // Biotechnol. and Bioeng.- 1998.- vol. 2., N 3.- p. 133−138.

5. Перт С.Дж. Основи культивування мікроорганізмів і клітин.- М.: Світ.- 1978.

6. Luedeking R., Piret E.L. A kinetic study of the lactic acid fermentation: Batch process at controlled pH // J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng.- 1959.- vol. 1., N 4.- p. 393−412.

7. Осипов Д. С., Гусельникова Т. В. та інших. Математична модель біосинтезу L-лейцина // Праці МГУИЭ.- 2001.- т.V.- з. 19−23.

8. Mori A., Terui G. Kinetic studies on submerged acetic acid fermentation: Inhibition by ethanol // J. Ferment. Technol.- 1972.- vol. 50, N 11.- p. 776−786.

9. Музыченко Л. А., Валуїв В.І. Використання полунепрерывного культивування мікроорганізмів щоб одержати продуктів біосинтезу // У кн.: Теорія і практика безперервного культивування мікроорганізмів.- Красноярськ.- 1978.- з. 112−113.

10. Bajpai R.K., Reuss M. A mechanistic model for penicillin production // J. Chem. Technol. and Biotechnol.- 1980.- vol. 30, — p. 332−344.

11. Баснакьян І.А., Бірюков В.В., Крилов Ю. М. Математичне опис основних кінетичних закономірностей процесу культивування мікроорганізмів // У кн.: Результати науку й техніки. Мікробіологія. Т. 5. Керовану і безупинне культивування мікроорганізмів.- М. — 1976.- з. 5−75.

12. Shu P. Mathematical model for product accumulation in microbiological processes // J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng.- 1961.- vol. 3, N 1, — p. 95−109.

13. Aiba P. S., Hara M. Conception of average cumulative age of microorganisms // J. Gen. and Appl. Microbiol.- 1965.- vol. 11, — p. 25−41.

14. Бірюков В.В., Кантере В. М. Оптимізація періодичних процесів мікробіологічного синтезу.- М.: Наука.- 1985.

15. Фишман В. М. Математичне письмо речей та оптимальне управління процесом біосинтезу антибіотиків // Діс. канд. техн. наук.- М.: Московський інститут хімічного машинобудування- 1970.

16. Ettler P., Votruba J. Determination of the optimal feeding regime during biosynthesis of erythromycin // Folia microbiol.- 1980.- vol. 25, — p. 424−429.