Трансплантація ембріонів. 
Трансплантація ембріонів

Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота является новым биотехнологическим приемом в селекции, основной эффект которого в увеличении количества потомков по материнской линии. Метод трансплантации эмбрионов включает следующие приемы: вызывание полиовуляции у доноров, извлечение эмбрионов, их сохранение и пересадка реципиентам.

Основным назначением метода на данном этапе является получение быков-производителей и маток воспроизводящих групп, а также сохранение генофонда.

Непременными условиями для проведения работ по трансплантации являются полноценное кормление и содержание животных, хорошая организация воспроизводства стада, а также наличие квалифицированных специалистов. На современном этапе развития метода трансплантации эмбрионы крупного рогатого скота можно получать как от коров постоянного донорского стада, так и от разовых доноров, извлекая эмбрионы не ранее 60 дней после отела, без вывода животных из основного стада, непосредственно в племзаводах.

Отбор животных в доноры эмбрионов Отбор животных в доноры проводит комиссия, в которую должны входить специалисты ветеринарной и племенной службы и специалисты по трансплантации эмбрионов.

Генетическое превосходство животного определяется ценностью его предков, длительностью хозяйственного использования, собственной продуктивностью и продуктивностью его потомства, а также соответствием стандарту (по типу) породы. При подборе коров-доноров для использования в целях сохранения генофонда локальных пород руководствуются задачами сохранения всего генетического разнообразия.

Донорами эмбрионов могут быть коровы со следующими признаками:

• — клинически здоровые, без признаков нарушения обмена веществ (ожирение, дистрофия и т. д.) и реагирующие полиовуляцией при гормональной обработке;
• — с межотельным периодом в предыдущих лакгациях 360−380 дней;
• — с сервис-периодом 70−90 дней;
• — проявлением первой охоты до 50 дней после отела;
• — легкостью отела и не осложненным течением послеродового периода;
• — индексом осеменения 1,2−1,5;
• — нормальным состоянием матки и яичников.

Отбор доноров по селекционным признакам Для получения ценного племенного материала необходимо матерей-доноров будущих производителей отбирать в стадах ведущих племенных хозяйств.

Отбор коров в доноры по состоянию половой системы и прогнозирование полиовуляции.

Из числа доноров сразу исключают коров с узким анусом, наличием эндометрита к 35 дню после отела, фолликулярными кистами, а также животных, имеющих незавершенную инволюцию матки к этому же сроку.

Отбирают животных с нормальным течением послеродового периода, у которых на протяжении 60 дней после отела зарегистрированы две овуляции и хотя бы одна выраженная охота. Коров, стабильно дающих качественные эмбрионы, ставят на особый учет для ежегодного использования в качестве доноров. При хорошей эмбрио продуктивности и выдающихся селекционных признаках коровы-донора можно планировать двух-трехразовое получение эмбриона.

Требования к коровам-донорам быков воспроизводящей группы:

• — высокая молочная продуктивность с учетом средней продуктивности за все лактации с выходом молочного жира и белка;
• — наличие данных о происхождении не менее, чем по трем рядам предков, принадлежащих к высокопродуктивному семейству, перспективной линии (желательно, чтобы отец коровы-донора имел племенные категории А, Б);
• — крепкая конституция и экстерьер с оценкой не ниже 8 баллов;
• — чашеобразная или ваннообразная форма вымени;
• — интенсивность молокоотдачи — 1,8−2,0 кг/мин;
• — живая масса — не ниже стандарта породы;
• — возраст (наиболее желательный) — от 3 до 6 отелов;
• — достоверность происхождения по группам крови.

Комплектование донорского стада Комплектование донорских стад осуществляют только из хозяйств, благополучных по заразным болезням животных, что должно быть подтверждено ветеринарным свидетельством или сертификатом.

На каждое животное оформляется ветеринарное свидетельство (форма № 1) с указанием клинического состояния здоровья, благополучия по бруцеллезу, туберкулезу, вирусным респираторным заболеваниям, лейкозу, трихомонозу, вибриозу, инфекционному ящуру.

Учитывая индивидуальные особенности животных по реакции полиовуляции, первоначально количество коров должно превышать потребность в донорах в 2−3 раза. Выявление коров-доноров проводится непосредственно в хозяйствах (на фермах) с использованием пробной гормональной обработки и извлечения эмбрионов. Окончательный отбор проводят после установления реакции коров на введение гонадотропных гормонов для вызывания полиовуляции. При отсутствии реакции на гормональную обработку корову в доноры не переводят.

Коров, прошедших разовую гормональную обработку и давших биологически полноценные эмбрионы за первую операцию, переводят в группу коров-доноров.

Подготовка коров в доноры эмбрионов Основным требованием отбора коров в доноры по физиологическому состоянию является отсутствие у них после отельных осложнений. Поэтому наибольшее значение приобретают профилактика и раннее лечение после отельных осложнений, которые необходимо осуществлять в сухостойный и послеродовой периоды.

Организация сухостойного периода коров, отобранных в доноры.

Нарушения процесса родов и послеродового периода часто связаны с причинами, возникающими задолго до отела. Поэтому необходимо начинать профилактику затрудненных отелов и после отельных осложнений у доноров с сухостойного периода важнейшего в воспроизводительном процессе.

При составлении рационов для доноров руководствуются нормами и рационами кормления («Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных», М., 1995).

Для профилактики после отельных осложнений коров обрабатывают эмульсией витамина, А и антисептика стимулятора Дорогова фракция 2 (АСД-Ф2). Непосредственно перед применением препараты АСД-Ф2 и витамина, А смешивают, тщательно взбалтывают до получения однородной эмульсии и вводят коровам за 30 дней до предполагаемого отела трехкратно внутримышечно с интервалом 5 дней. Однократная доза витамина, А — 7−10 см" (500−800 тыс. ИЕ), АСД-Ф2 — 1,7−2.0 см' (0,003−0,004 см³ на 1 кг массы животного) («Наставление по применению витамина, А и АСД-Ф2 для профилактики задержания последа у коров», 1988 г.).

Коров в сухостойный период необходимо зимой выпускать на прогулку в загоны или устраивать активный моцион до 2 км, а летом содержать на пастбище.

Организация содержания и кормления коров-доноров, а послеродовой период и при получении эмбрионов.

Для предупреждения после отельных осложнений, своевременного возобновления циклической активности яичников и восстановления матки на 2−3 день после отела проводят фармако-профилактику с внутриматочным введением антимикробных препаратов. Наиболее эффективным в этот период является применение антибиотиков широкого спектра действия в сочетании с йодистыми препаратами.

Профилактика предполагает систематическое наблюдение за животными. С 10 дня после отела состояние яичников и матки коровы определяют методом ректального исследования с интервалом 5−7 дней. Каждую неделю (до появления охоты) проводят витаминизацию — 1 млн. ИЕ витамина А. При первых признаках эндометрита необходимо сразу же начинать интенсивное лечение.

К 50 дню после отела половая система донора должна придти в норму. Животное должно проявить охоту с полноценной овуляцией и четкими внешними признаками.

Для получения наибольшей эмбриопродуктивности необходимо организовать индивидуальное нормированное кормление доноров с учетом изменения живой массы и молочной продуктивности, потребности в питательных веществах по месяцам лактации.

Обработка коров-доноров для получения эмбрионов Гормональная обработка коров для вызывания полиовуляции Гормональную обработку с целью индуцирования реакции полиовуляции начинают через 50−60 дней после отела. Перед этим контролируют состояние половой системы коровы с помощью ректогенитального обследования. Наличие выраженной охоты и хорошо сформированного желтого тела в одном из яичников на 8−14 день цикла являются показанием для начала гормональной обработки. В случае отсутствия признаков явной охоты или ее пропуске, но нормальном состоянии половой системы стимулируют охоту введением аналогов простагландина Р-2а.

Полиовуляцию вызывают введением гипофизарного препарата фолликулостимулирующего гормона ФСГ-супер.

Примерные схемы обработок для вызывания полиовуляции представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Примерные схемы обработок коров для вызывания полиовуляции.

ФСГ вводят на протяжении 4−5 дней, дважды в сутки в одинаковых или убывающих дозах с интервалом 12 часов.

Подготовкупрепарата ФСГ-супер проводят в соответствии с наставлением. Растворы препарата во время обработок (4−5 дней) хранят в холодильнике в соответствии с правилами асептики. Для более длительного периода хранения необходимо поместить раствор в морозильную камеру.

Часто отсутствие реакции полиовуляции может быть вызвано передозировкой гонадотропина. Поэтому лучше сначала применить суммарную дозу ФСГ 28−30 мг. Если корова не отреагировала, то дозу увеличивают на 50%, в самом крайнем случае — на 100%. Доза препарата, превышающая 50 мг, не увеличивает количество овуляций и выход качественных эмбрионов.

Сочетанное применение гормональных средств с другими биологически активными веществами и стимуляция первого пула фолликулов повышают выход качественных эмбрионов (табл. 13.2).

Таблица 13.2.

Схема обработки с предварительной стимуляцией фоллнкулогенеза.

Витамин, А вводят с АСД-Ф2. Для этого непосредственно перед инъекцией оба препарата тщательно смешивают и полученную эмульсию вводят внутримышечно.

Повторную гормональную обработку коров проводят с учетом индивидуальных особенностей животных через 2−3 половых цикла после спонтанной охоты.

Осеменение доноров Охота у доноров с полиовуляцией обычно начинается через 36−48 часов после введения простагландинов. Коров при полиовуляции осеменяют 3 раза с 12-часовыми интервалами. Первое осеменение проводят спустя 8−12 часов после начала охоты. Метод осеменения — ректоцервикальный. Маноцервикальный метод осеменения доноров не допускается. Сперму вводят в теломаткиили в оба рога.

Введение

спермы в один из рогов матки при осеменении доноров недопустимо. Осеменение проводят двойной дозой семени (неменее 50 млн. подвижных сперматозоидов).

Если корова-донор не проявляет внешних признаков охоты при наличии зрелых фолликулови течки, ее осеменяют через 60 и 70 часов после инъекции простагяандинов.

Подготовка инструментов я приготовление сред Подготовка эмбрионального фильтра ФЭ-1. Перед работой чистый и сухой эмбриональный фильтр споласкивают 70° спиртом, затем дистиллированной водой и высушивают. Стерилизуют фильтр под ультрафиолетовой лампой в течение I часа на расстоянии не более 70 см.

По окончании работы фильтр споласкивают проточной водой, с помощью мыльного раствора мягкой кисточкой очищают поверхность сеток фильтра от налипшей слизи, затем фильтр 3−4раза споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Приготовление сред для извлечения и культивирования эмбрионов.

Приготовление растворов проводят в стерильных условиях, используя стерильную посуду, которую вскрывают непосредственно перед употреблением.

При работе с эмбрионами применяют модифицированный сбалансированный солевой раствор Дюльбекко (ФБС). Для пунктов трансплантации этот раствор должен поступать в готовом (растворенном) виде. Непосредственно перед работой по извлечению эмбрионов в раствор ФБС добавляют 2% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота.

Для кратковременного культивирования и приготовления криозащнтных сред используют раствор Дюльбекко с добавлением 15% фетальной сыворотки крупного рогатого скота или бычьего сывороточного альбумина из расчета 4 г/л среды. Все препараты должны быть стерильны.

Санацию сред для извлечения и культивирования проводят санирующими препаратами (канамицином, пенициллином, ГАМПом, полигеном и др.), не имеющими эмбриотоксического действия, согласно наставлению по их применению.

Перед использованием готовую среду для культивирования фильтруют через бактериальный мембранный фильтр (диаметр пор — 0,22 мкм).

Приготовление сред для замораживания эмбрионов.

Среду для замораживания эмбрионов готовят из реактивов высокой степени чистоты (ХЧ и ЧДА). Глицерин — основной компонент криозавдитной среды для замораживания эмбрионов.

Для стерилизации глицерин помещают во флакончиках в сушильный шкаф при температуре 100…110°С и выдерживают 20−30 минут. Затем плотно закупоривают стерильной пробкой и хранят до использования в темном месте.

Для замораживания эмбрионов готовят 1,5 М и 0,75 М растворы глицерина.

Для приготовления 1,5 М раствора глицерина к 9,5 см среды культивирования с санирующим препаратом добавляют 1,2 см глицерина. 0,75 М раствор глицерина получают разбавлением в два раза 1,5 М раствора глицерина средой культивирования.

Приготовление сред для оттаивания эмбрионов Среды для оттаивания можно приготовить заранее, разлить в стерильные флаконы и хранить в замороженном состоянии.

Схема приготовления основных сред для оттаивания:

• — среда, А — 15% раствор фетальной сыворотки или 0,4% раствор бычьего сывороточного альбумина на среде Дюльбекко с санирующим препаратом;
• — среда Б — 10% раствор глицерина (10 см³ глицерина разбавляют до 100 см³ средой А);
• — среда В — 1 М раствор сахарозы (34,23 г сахарозы разбавляют до 100 см³ средой А).

Схема приготовления рабочих сред представлена в таблице 13.3.

Таблица 13.3.

Приготовление сред для оттаивания эмбрионов.

Среды фильтруют в стерильную посуду через бактериальные мембранные фильтры (диаметр пор — 0,22 мкм) и используют для приготовления сред для оттаивания и культивирования эмбрионов.