Білок остеопонтину

Структура і пояснюються деякі властивості білка остеопонтина.

В нього дедалі більшої уваги дослідників приваблюють белки-цитокины, втягнуті у процеси остеогенеза і дентогенеза, і навіть реконструкції денты й кісткового тканини. Вивчаються молекулярні механізми дії даних білків, регуляція експресії їх генів, розподіл у різних типах тканин, вишукуються речовини — інгібітори чи, навпаки, активатори їх біологічну активність тощо. буд. Причиною такої пильної уваги не лише необхідність отримання грунтовних знань про структурних засадах їх біологічної активності, а й роль ростових чинників у розвитку цілого ряду захворювань людини. Адгезивные білки, й белки-цитокины кістковій тканині залучені в патогенез остеопорозу, остеопетроза, розвиток первинних і вторинних остеосарком різного походження, і навіть виправлення механічних ушкоджень кістки і денты, тощо. Однією з найпоширеніших патологій кістковій тканині є остеопороз — захворювання, що призводять до деминерализации і деструкції кістки. Тільки США перевищив на сьогодні на нього страждають понад десять млн. людина, що визначає потреба у ефективному лікарському засобі для терапії остеопорозу та профілактики пов’язаних із нею механічних ушкоджень кістки. Протягом останніх кілька років було розроблено й успішно випробуваний метод лікування остеопорозу з допомогою поміркованих доз препаратів паратиреоидного гормону. Як засвідчили клінічних досліджень, гормонотерапія прискорює формування нової кістковій тканині, і навіть збільшує її щільність. У той самий час, проведені на модельних тварин дослідження дозволив встановити, що остеогенез — активуючі дію паратиреоидного гормону багато в чому зумовлено активністю остеопонтина (OP) — однієї з адгезивных білків кісткового матриксу, втягненого у процес резорбції кістки через одночасне взаємодію Космосу з кісткової поверхнею і остеокластами. Кісткова тканину й дента тварин і людини містить низку фосфорилированых сиалопротеинов. До них належать: BSP (кістковий сиалопротеин), BAG-75 (кислий кістковий гликопротеин-75), DMP1 (протеїн матриксу денты-1), DSP (сиалопротеин денты), OP та інших. Першим із яких був відкрито й вивчений фрагмент кісткового сиалопротеина (BSP) (Herring G.M., 1972). Пізніше, після введення інгібітору протеиназ в екстракт тканини кістки (Oegema T., et.al., 1975), були описані властивості полноразмерного білка. Наступне клонування й визначення нуклеотидної послідовності кДНК BSP (Oldbarg A., et al., 1988) дозволило визначити трансляцією по знайденою відкритої рамці зчитування повну аминокислотную послідовність. Використання відпрацьованих щодо BSP прийомів роботи з кісткової тканиною дало надалі можливість виділити й охарактеризувати велика кількість кісткових білків, які мають адгезивними і цитокинетическими властивостями. Однією з таких білків і є остеопонтин — OP. Остеопонтин людини уперше виділена і ідентифікований в 1985 р. (Franzen A., et al., 1985) Пізніше була клонирована кДНК OP миші і визначено її нуклеотидная послідовність, аминокислотная послідовність білка, а згодом і повна экзон-интронная організація гена (Miyazaki Y., et al., 1990). Повнорозмірний ген OP людини клонували, використовуючи як гибридизационных зондів мічені фрагменти кДНК OP миші. Порівняння структурної і функціональної організації двох генів виявило ряд загальних властивостей. Зокрема, обидва гена беруть у свій склад сім экзонов, які регуляторні області містять низку схожих консенсусних послідовностей. У той самий час, третій интрон гена OP людини містить вставку довжиною 1,8 тисяч пар підстав. Подальше вивчення регуляції експресії генів OP миші і авторитетної людини, як і шляху сплайсингу їх мРНК у різних лініях клітин та типах тканин дозволить надалі визначити функціональне значення особливостей організації генів OP із джерел (Hijiya N., et al., 1994). OP — секреторный сиалопротеин, про-пептид якого утворюється 314 аминокислотными залишками (а. про.), із яких частку лідируючої послідовності доводиться 16 а. про. OP виявився трішки менше кислим, ніж BSP, та його аминокислотная послідовність, як було встановлено (Hijiya N., et al., 1994) включає кілька блоків із залишків дикарбоновых амінокислот, причому один загальної довжиною дев’ять залишків (див. малюнок). Білок O-гликозилирован (Franzen A., et al., 1985) і має ряд фосфорилированных залишків серина (Heinegard D., et al., 1989). Порівняння амінокислотною послідовності OP з первинними структурами інших кісткових білків позбавила змоги знайти протяжних ділянок значної гомології. У той самий час, аминокислотная послідовність OP містить у собі консенсусний RGD-участок. Ця структура відповідає у низці білків — BSP (Oldbarg A., et al., 1988) та інших., за взаємодію Космосу з які перебувають лежить на поверхні клітин рецепторами сімейства интегринов, і уперше було встановлено в що відповідає за зв’язування клітин домені білка фибронектина (Ruoslahti E. et al., 1987). Цікаво зазначити, що, як було виявлено у процесі виділення, OP здатний досить міцно зв’язуватися з гидроксиапатитом (Franzen A., et al., 1985). Це можна пояснити його функціями в минерализованной кістковій тканині. Слід сказати, хоча у попередні роки ряд білків кісткового матриксу було виділено і охарактеризований, нині є всього лише припущення стосовно можливої функціональної ролі декого з тих. Жоден з цих білків перестав бути унікальним з погляду локалізації в кістковій тканині. Усі вони також є та інших типах тканин, у своїй OP трохи більше обмежений у локалізації проти іншими білкам. Так, рівень мРНК OP, високий в кістковій тканині, також суттєвий й у нирках. Цей білок, як було зазначено показано, часто входить до складу ниркових рифів і, цілком імовірно, впливає їх формування (Nemir M., et al., 1989). Було, зокрема, показано присутність OP в кальций-фосфатных ниркових каменях. З іншого боку, виявлено зв’язок між низьким змістом даного білка в урине пацієнтів і формуванням каменів оксалатной природи (Nishio P. S., et al., 2000). Значний рівень накопичення OP знайшли у плаценті і тканинах мозку (Nomura P. S., et al., 1988). Ген OP экспрессируется також у багатьох клітинних лініях, де виявляє різні типи експресії. Конститутивна експресія OP знайдено у клітинах з кістковій тканині, нирок плаценти, нервових клітинах, макрофагах (Patarca R., et al., 1989). У той самий час индуцибельный тип зафіксований у T-лимфоцитах, клітинах епідермісу. Посилення експресії відбувається під впливом різних агентів: 1,25 дигидроксивитамина D3, основного чинника зростання фібробластів (bFGF), чинника некрозу пухлини (TNF), интерлейкина-1 (IL-1), липополисахаридов, g-интерферона (g-IFN) (Hijiya N., et al., 1994). До того ж, експресія гена OP відбувається за неопластическом стані клітини (Sendger D., et al., 1988; Nemoto H., et al., 2001). Отже, регуляція експресії гена OP перебуває під комплексної системою контролю, яка може відрізнятися у клітин різних типів. Зокрема, для вивчення ролі OP у процесах формуванні кістки, провели початкова дослідження впливу рівень накопичення OP мРНК в остеобластах з остеосаркомы (лінія ROS 17/2.8) різних чинників, які впливають регуляцію розвитку і відновлення кістки. Знайшли, що 1,25-дигидроксивитамин-D3 у кілька разів підвищує і рівень накопичення мРНК, і секрецію зрілого білка з клітин. Ці дані показують, що синтез OP позитивно регулюється вітаміном D3, тобто. чинником, индуцирующим мобілізацію кальцію з кістки. На думку авторів монографії (Heingard D., et. al., 1990), це, швидше за все, пов’язані з індукцією активності остеокластов. Цікаво, що у літературним даним ген іншого кісткового сиалопротеина — BSP, піддається негативною регуляції вітаміном D3, але позитивно регулюється глюкокортикоидами (Oldberg A., et al., 1989). Через те, що білок має у собі консенсусну RGD-последовательность, і навіть має здатність зв’язуватися з гидроксиапатитом, можна було очікувати, що OP втягнутий у зв’язування остеокластов на минерализованной поверхні кістки (Graig A., et al., 1989). Справді, пізніше засвідчили зв’язування остеокластов з OP, нанесеним на поверхню зі скла та пластика (Oldbarg A., et al., 1986). У багатьох наступних експериментів було також виявлено, що зв’язування ізольованих остеокластов з OP може ингибироваться синтетичним пептидом RGD, але з контрольним RGE, і навіть моноклональными антитілами до фрагмента амінокислотною послідовності OP, що містить RGD-консенсусный сайт (Bautista D., et al., 1994). Функціональна роль RGD-структуры була додатково підтверджено створенням шляхом сайт-направленного мутагенезу форм OP людини з аминокислотными замінами (Xuan J., et al., 1994). Отримані дані спонукали деяких дослідників спробувати визначити тип і субъединичный склад втягнутої у взаємодію Космосу з OP интегрина остеокластов. Проведені засвідчили, що тільки антитіла до avb3-интегрину ингибировали зв’язування клітин із OP. Ці дані показують, що зв’язування ізольованих остеокластов з OP, очевидно, опосередковується avb3-интегрином (Bautista D., et al., 1994). Цей тип интегринов є рецептором витронектина як було раніше продемонстровано, локалізується на мембрані ізольованих остеокласт-подобных гігантських клітинах людини. Можливо, що микроокружение лежить на поверхні остеокластов може індукувати специфічну конформацию avb3-интегрина, що дозволяє йому зв’язуватися тільки з OP, тобто. специфічність клітинного зв’язування то, можливо высокоизбирательной (Cheng P. S., et al., 2001). Цікаво, що у проксимальній області OP за RGD-последовательностью перебуває сайт розщеплення тромбіном.

.

Как показали проведені останні кілька років дослідження, те що in vivo розщеплення OP тромбіном має істотне фізіологічне значення (O «Regan A, Berman J. 2000; Denhardt D., et al., 2001; Yokasaki Y, Sheppard D., 2000; Asou Y., et al., 2001). Зокрема, отримані дані дозволили переконливо продемонструвати, що на відміну від нативного OP, його N-терминальный фрагмент, який містить RGD-домен, підтримує адгезію ліній клітин меланоми. Це вимагає, деякі адгезивные властивості OP контролюється через розщеплення тромбіном. Було так само виявлено, що OP містить приховані сайти зв’язування, які можуть опинитися взаємодіяти із чудовими від avb3 типами рецепторів. Згодом були ідентифіковані нові рецептори интегринового низки (avb1, avb5, a4b1, a5b1, a8b1, a9b1) (Smith L.L., et al., 1996; Bayless KJ, Davis GE., 2001) та інших видів (CD44v6, CD44v7) (Wittig, B.M., et al., 2000; Lin, Y.H. et al. 2000), відповідальні за взаємодії OP з поверхнею різних типів клітин.

Herring G.M. The organic matrix of bone.// The Biochemistry and Physiology of bone., 1972., G.H. Bourne, Ed. V. 1., P. 127 — 189., Academic Press., New York. Oegema T., Hascall V., Dziewiatkowski. Isolation and characterization of proteoglycans from the Swarm rat chondrosarcoma.// J.Biol.Chem., 1975., V.250., P. 6151 — 6159. Oldbarg A., Franzen A., Heinegard D. The Primary Structure of a Cell-binding Bone Sialoprotein.// J. Biol. Chem., 1988., V. 263., P. 19 430 — 19 432. Franzen A., Heinegard D. Isolation and characterisation of two sialoproteins present only in bone calcified matrix.// Biochem. J., 1985., V. 232., P. 715 — 724. Miyazaki Y., Setoguchi M., Yoshida P. S., Higuchi Y., Akizuki P. S., Yamamoto P. S.// J. Biol. Chem., 1990., V. 265., P.14 432 — 14 438. Hijiya N., Setoguchi M., Higuchi Y., Akizuki P. S., Yamamoto P. S. Cloning and characterization of the human osteopontine gene and its promoter.// Biochem. J., 1994., V. 303., P. 255 — 262. Heinegard D., Hultenby K., Oldberg A., Reinolt F., Wendel M. Macromolecules in bone matrix.// Connect. Tissue Res., 1989., V.21., P. 3 -14. Ruoslahti E., Pierschabacher M. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins.// Science, 1987., V.238., P. 491 — 497. Nemir M., DeVouge W., Mukherjee B. Normal rat kidney cells secrete both phosphorylated and nonphosphorylated forms of osteopontin showing different physiological properties.//J. Biol. Chem., 1989., V. 164., P.18 202 — 18 208. Nishio P. S, Hatanaka M, Takeda H, Aoki K, Iseda T, Iwata H, Yokoyama M. Calcium phosphate crystal-associated proteins: alpha2-HS-glycoprotein, prothrombin F1, and osteopontin.// Mol. Urol., 2000, V.4., P. 383 — 390. Nomura P. S., Wills A., Edwards D., Hearth J., Hogan B. Developmental expression of 2ar (osteopontin) and SPARC (osteonectin) RNA as revealed by in situ hybridization.// J. Cell Biol., 1988., V. 106., P. 441 — 450. Patarca R., Freeman G., Singh R., Wei F., Durfee T., Blattner F., regner D., Kozak З., Mock B., Morse H., Jerells T., Cantor H. Structural and functional studies of the early T-lymphocyte activation 1 (Eta-1) gene.// J. Exp. Med., 1989., V. 170., P. 145 — 161. Sendger D., Perruzzi З., Gracey З., Papadopoulos A., Tenen D. Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation. Close homhlogy with plasma proteins cleaved during blood coagulation.// Cancer Res. 1988., V.48., P. 5770 — 5774. Nemoto H, Rittling SR, Yoshitake H, Furuya K, Amagasa T, Tsuji K, Nifuji A, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin deficiency reduces experimental tumor cell metastasis to bone and soft tissues.// J. Bone Miner Res., 2001., V.16 P. 652 — 659. Heingard D., Jirskog-Hed A., Oldberg A., Reinholt F., Weindel M. Bone macromolecules.// Calcium Regulation and Bone Metabolism. Basic and Clinical Asprct., D.V.Cohn, F.H.Gloriex& T.J.Martin, Eds., 1990., V. 10., P. 181 — 187, Excerpta Medica., Elsevier., Amsterdam. Oldberg A., Jirskog-Hed B., Axelsson P. S., Heinegard D. Regulation of bone sialoprotein (BSP) mRNA by steroid hormones. // J. Cell Biol., 1989., V. 109., P. 3183 — 3186. Graig A., Smith J., Denhardt D. Osteopontin, a transformation-associated cell adhesion phosphoprotein, is induced by 12-O-tetradecanolphorbol-13-acetat in mouse epidermis.// J. Biol. Chem., 1989., V. 164., P. 9682 — 9689. Oldbarg A., Franzen A., Heinegard D. Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence.// PNAS USA, 1986., V. 83. P. 8819 — 8823. Bautista D, Xuan J., Hota З., Chambers A., Harris J. Inhibition of Arg-Gly-asp (RGD)-mediated Cell Adhesion to osteopontin by a Monoclonal antibogy against Osteopontin.// J. Biol. Chem., 1994., V. 269., P. 23 280 — 23 285. Xuan J., Hota З., Chambers A. Recombinant GCT-human Osteopontin Fusion Protein Is functional in RGD-Depended Cell Adhesion.// J. Cellular Biochemistry, 1994., V.54., P. 247 — 255. Cheng P. S., Lai З., Blystone P. S., Avioli L. Bone mineralization and osteoblast differentiation are negatively modulated by integrin avb3.// J. Bone Miner Res., 2001., V. 16., P. 277 — 288. O «Regan A, Berman J. Osteopontin: a key cytokine in cell-mediated and granulomatous inflammation.// Int. J. Exp. Pathol., 2000, V. 81., P. 373 — 390. Denhardt D., Giachelli З., Rittling R. Role of osteopontin in cellular signaling and toxicant injury./Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2001, V.41, P.723 — 749. Yokasaki Y, Sheppard D. Mapping of the cryptic integrin-binding site in osteopontin suggests a new mechanism by which thrombin can regulate inflammation and tissue repair.//Trends Cardiovasc. Med., 2000., V.10. P.155 — 159. Asou Y, Rittling SR, Yoshitake H, Tsuji K, Shinomiya K, Nifuji A, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin facilitates angiogenesis, accumulation of osteoclasts, and resorption in ectopic bone.// Endocrinology 2001., V. 142., P. 1325 — 32.