Методи трансгенеза у тваринництві
Не дивлячись на використання великого числа маркерів, не було розроблено системи, що дозволяє підвищити ефективність трансгенеза у сільськогосподарських тварин. Основні підходи, що використовуються в даний час: Для більш точного розрахунку концентрації генних конструкцій використовують наступну формулу: Кількість копій (копій ПЛК) = 6,023 * 10 23 * З * 10 — 9/Mr, де 6,023 * 10 23 — число копій… Читати ще >
Методи трансгенеза у тваринництві (реферат, курсова, диплом, контрольна)
Трансгенні тварини — це індивідууми, в геном яких штучно введена додаткова генетична інформація (Трансген). Така інформація представляє собою або окрему ділянку ДНК з власними (гомологічними) регуляторними послідовностями (еукаріотична транскрипційних одиниця), або сконструйований з різних молекул ДНК гібридний (рекомбінантний) ген. Таким чином, трансгени — це штучно введений та інтегруватися в ДНК тварин чужорідний ген. Під трансгенезом розуміють процес перенесення та інтеграції чужорідної генетичної інформації в геном тварин.
Метод мікроін'єкції
Вперше про отримання трансгенних сільськогосподарських тварин повідомили дві лабораторії в США та Німеччині [Hammer et al, 1985; Brem et al., 1985]. В обох випадках для переносу генних конструкцій у ембріональні лінії був використаний метод мікроін'єкції. Цей метод і сьогодні залишається найбільш широко використовуваним для трансгенеза у тваринництві.
Суть методу мікроін'єкції полягає у введенні розчину генних конструкцій в чоловічій пронуклеус зигот. Зазвичай ін'єцирують 1−2 ПКЛ розчину ДНК в концентрації, що відповідає 1000 копій в 1 ПКЛ мікроін'єкціонного розчину. При цьому виходять з того, що кількість 1000 копій / ПКЛ приблизно відповідає концентрації X нг / мкл, де X — довжина генної конструкції в тисячах парах нуклеотидів (т.п. н). Наприклад, якщо довжина генної конструкції дорівнює 10 т.п. н., то кількість 1000 копій в 1 ПКЛ буде досягатися при концентрації рівної 10 нг / мкл.
Для більш точного розрахунку концентрації генних конструкцій використовують наступну формулу:
Кількість копій (копій ПЛК) = 6,023 * 10 23 * З * 10 — 9/Mr, де 6,023 * 10 23 — число копій в 1 М розчині;
С — концентрація ДНК [мкг / мл];
Mr — молекулярна маса [мг / моль].
Для розрахунку концентрації вимірюють оптичну щільність розчину генної конструкції на спектрофотометрі при довжині хвилі 260 нм. 1 OD відповідає концентрації двуточечною ДНК дорівнює 50 мкг / мл. При розрахунку молекулярної маси виходять з того, що молекулярна маса 1 пар основ дорівнює 6,6 * 108 мг / моль.
Про успішне виконання мікроін'єкції судять по збільшенню обсягу пронуклеусів в 1,5−2 рази [Брем та ін, 1995]. У ембріонах мишей кроликів, овець і кіз пронуклеус досить добре візуалізуються під мікроскопом при збільшенні Х400 без виконання будь-яких додаткових маніпуляцій. Що стосується ембріонів свиней і великої рогатої худоби, то внаслідок наявності в цитоплазмі темних ліпідосодержащіх гранул визначення місця розташування пронуклеусов в них утруднено. Для усунення цих гранул до країв ембріона і полегшення тим самим локалізації пронуклеусов виконують центрифугування ембріонів свиней та ВРХ при 15 000 об / хв протягом 3 хв. [Wall et ai, 1985]. По завершенні мікроін'єкції ембріони культивують кілька годин до моменту їх пересадки в яйцепровід синхронізованих реципієнтів. Ембріони ВРХ культивують in vitro протягом 6−7 днів до досягнення ними стадій морули або бластоцисти і потім виконують пересадку в матку синхронізованих реципієнтів. Після народження від всіх тварин відбирають проби тканини для аналізу на інтеграцію трансгена. Ступінь інтеграції, тобто число трансгенних тварин від загального числа народжених тварин, при використанні методу мікроін'єкції в залежності від виду тварин коливається в незначних межах. Так, у мишей цей показник у середньому становить 15%, у свиней — 10−15%, у кроликів — 10%, у овець, кіз і ВРХ — 5−10% [Брем ??та ін, 1995]. Найбільш важливим, з точки зору витрат, потрібних для отримання одного трансгенної тварини, є показник загальної ефективності трансгенеза, який розраховується як відношення числа отриманих трансгенних тварин до загальної кількості пересаджених ембріонів, виражене у відсотках. Величина цього показника також щодо постійна і становить у мишей — 2%, у кроликів 1%, у овець і кіз — 0,5 — 1%, у свиней та ВРХ — 0,5%. На частоту інтеграції впливає ступінь очищення ін'єкційного розчину, форма і концентрація ДНК, склад буферного розчину, якість ембріонів, спосіб пересадки ембріонів реципієнтам (не хірургічний, хірургічний, лапароскопічний). При використанні розчину MSOF (синтетична середу ембріонів) для мікроін'єкції зигот великої рогатої худоби (Hageman [1995]) було показано, що ін'єкція розчину MSOF не чинила впливу на життєздатність ембріонів великої рогатої худоби, отриманих in vitro. Так, частки ембріонів, що розвинулися до стадії бластоцисти, в групах MSOF та контрольної становили, відповідно, 27,6% і 27,5%. У групі ТІ до стадії бластоцисти розвинулися лише 13,9% ін'єктовані зигот. Зіставляючи результати двох наведених вище досліджень, можна припустити, що буфер MSOF виявиться більш ефективним у порівнянні зі стандартним розчином ТІ для отримання трансгенного великої рогатої cкота та інших видів сільськогосподарських тварин.
Не дивлячись на досягнуті в області трансгенеза успіхи, ефективність одержання трансгенних сільськогосподарських тварин залишається дуже низькою [Wall et al., 1992; Wall et al. 1997] що спонукає дослідників шукати нові підходи. Одним із шляхів підвищення ефективності трансгенеза є розробка методів оцінки ембріонів на трансгенність перед їх пересадкою реципієнтам. До них відноситься використання в конструкціях репортерний генів, таких як в-галактозидаза, лужна фосфотаза та інші, а також визначення трансгенів в ембріонах методом ПЛР і флюоресцентної гібридизації.
Не дивлячись на використання великого числа маркерів, не було розроблено системи, що дозволяє підвищити ефективність трансгенеза у сільськогосподарських тварин. Основні підходи, що використовуються в даний час: