Экспресс-диагностика особливо небезпечних інфекцій

Экспресс-диагностика особливо небезпечних инфекций

Выполнил: Новак О. Л., 301 грн., л/ф, Владивосток, 1998.

Актуальность проблеми

Особо небезпечні інфекції (ООИ) — це інфекції, які можуть опинитися виникати серед населення у вигляді окремих захворювань, епідемій і навіть пандемій, частіше супроводжуючи НС (стихійні лиха, війни, масовий голод тощо.), які характеризуються природної очаговостью, швидким поширенням і важким течією. Єдиного в усьому світі думки у тому, які інфекції слід зараховувати до ООИ ми маємо, вітчизняні епідеміологи дотримуються такого перечня:

Чума.

Туляремия.

Миелоидоз.

Геморрагические лихоманки.

Желтая лихоманка.

Холера.

Генерализованная форма сибірки.

Наиболее ймовірне поява ООИ можливо під час НС. Різке погіршення санітарно-гігієнічних умов загострює епідемічну ситуацію по інфекцій, які раннє мали ендемічних характер, а завезение інфекції ззовні прибулими особами призводить до того, що потенційні джерела інфекції виявляються неизолированными і протягом багато часу мають численні контакти з оточуючими їх особами. У зв’язку з цим до встановлення остаточного діагнозу захворювання дотримується суворий протиепідемічний режим.

При перших ознаках чи підозрі на ООИ здійснюється:

Выявление контактних осіб та його обсервація;

Дача антибіотиків широкого спектра дії (доксицилин, тетрациклін та інших.), тобто. екстрена профілактика;

Проведение дезінфекційних заходів;

Отбор матеріалу від з онкозахворюваннями та доставка їх у лабораторію для мікробіологічного дослідження;

Организация часткової (повної) санобробки конкретних осіб.

В цій роботі розбирається етап діагностики ООИ з прикладу чуми, холери і туляремії. Якщо діагноз встановлено з достатньої достовірністю, можна визначити характер протиепідемічних заходів, встановити можливий джерело інфекції і механізми передачі. Саме з цього необхідне й виправдано застосування експрес-методів діагностики ООИ.

Общие принципи експрес-діагностики станів інфекції і імунітету

Современная імунологія виключно багатолика, а сфери застосування імунологічних знань і методів безмежно різноманітні. Їх використовують практично переважають у всіх розділах біології, ветеринарії та східної медицини — від фундаментальних молекулярно-біологічних дослідженні до медико-генетичного консультування та інших суто практичних процедур, здійснюваних растениеводами, тваринниками і медиками. І, тим щонайменше, особливо важливо у соціальному плані місто й методично найбільш передовим продовжують бути той найстарший і неухильно що розвивається розділ імунології, успіхами якого забезпечується розвиток теорії та здійснення практики протиепідемічної работы-диагностики, профілактики і лікування інфекційних захворювань. А методи імунологічної експрес-діагностики мають ключове значення для розв’язання названих труднощів і всіх відповідних протиепідемічних заходів. Наступні нижче матеріали і були приурочені саме тому поділу прикладної імунології, його станові й існувати перспективам розвитку.

Важнейшей передумовою ефективності будь-яких протиепідемічних заходів своєчасне прогнозування і виявлення моментів активізації тих екологічних і соціально-екологічних взаємодій, що є істота епідемічних процесів. Виключне розмаїтість, властиве останнім, і яка потребує диференціації протиепідемічних заходів, зумовлено не лише самобутністю кожної з існуючого безлічі інфекційних захворювань. Дуже велика значення має тут цьому плані фундаментальне явище гетерогенності популяцій, входять до складу відповідних екологічних та соціально-екологічних систем микроб-жертва. Вариабильность цих дуже складних биосоциальных факторів, і умов у дуже великі мері впливає специфіку тієї чи іншої етапу існування кожного епідемічного процесу. І своєчасне розпізнавання цих особливостей, здійснюване, зазвичай, з використанням імунологічних методів, забезпечує ту диференціацію протиепідемічних мероприятий.

Экспресс-индикация — це розвідка великою армією лабораторної діагностики. Вона перебуває в передньому краї наукового пошуку нових, простих, економічних, швидких методів індикації мікробів, частина з яких подальшому йде озброєння лабораторної практики і таким чином остання постійно вдосконалюється.

Основные об'єктивні вимоги до экспрессным методам діагностики інфекційних захворювань зводяться ось до чого:

1. отримання результатів аналізу, у максимально стислі терміни (годинник, идеально-минуты);

2. можливість проведення та завершення аналізу без виділення шуканого мікроорганізму у чистій культурі, під час використання лише нативного матеріалу, в крайньому случае-с залученням элективных биосред до швидшого накопичення збудників;

3. безперечно висока специфічність та висока чутливість, як передумови належної достовірності аналізу;

4. висока продуктивність, простота, доступність і відтворюваність аналізів.

Эти вимоги однаково застосовні і до методів экспрессной діагностики станів імунітету. Перевагу використання тієї чи іншої з методів експрес-діагностики залежить багатьох конкретних умов. Проте найбільш бажаним є паралельне використання 2−3 методів. Такий підхід значно збільшує надійність одержуваного результату.

На найближчі роки найперспективнішими такі напрями розвитку экспресс-индикации мікроорганізмів.

Энзимоиндикационное напрям, що з экспресс-индикацией біохімічних властивостей і визначенням ферментативного спектра мікробів. Як і раніше збережуть свою значимість дослідження з розробці политропных (полисубстратных) поживних середовищ. У нашій нашій країні було розроблено оригінальні политропные середовища проживання і їх комбінації, котрі з успіхом застосовують у лабораторної практиці. Під час створення складних полікомпонентних поживних систем необхідно виходити із різних біохімічних і енергетичних потреб мікроорганізмів. Для кращого прояви життєдіяльності і біохімічної активності патогенних та інших мікробів у середовищі необхідно створити оптимальні умови їхнього розвитку і розмноження і водночас вводити ферментируемые субстрати (вуглеводи, многоатомные спирти, амінокислоти та інших.) з найвідчутнішими індикаторами, які швидко б реєстрували їх ферментацію. Через війну застосування оптимальних полисубстратных середовищ виробляється виділення й накопичення чистої культури мікробів з одночасним визначенням їх біохімічних ознак. Перспективним слід розглядати розвиток энзимоиндикационных методів, у яких субстрат з індикатором відділений від живильне середовище і фіксований на спеціальному носії. У нашій країні розроблено углеводно-бумажные диски з захисної плівкою (паперові реагенти визначення дезаминаз у мікробів) і їх відповідники БІС (бумажно-индикаторные системи), углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные плівки. Всі ці препарати є дуже перспективними, вказують протягом найкоротшого терміну (3−5 год), використовуючи узвичаєні живильні середовища проживання і лабораторну посуд, визначати ферментативну активність різних видів мікроорганізмів. Автономний препарат — карандаш-фермент, яка має аналогів ні в нас там, дозволяє без застосування поживних середовищ безпосередньо на матеріальному склі визначати біохімічні властивості мікробів. Полисубстратная тест-система і энзимоиндикаторная стрічка йдуть на одночасної ідентифікації 20 біохімічних ознак у мікробів. Це нові види простих «довгоживучих «препаратів, виділені на швидкого й економічного визначення біохімічних властивостей мікробів. Електрофізичний метод визначення ферментативної активності мікробів включає посів мікробної культури на рідкі живильні середовища, містять пептонную воду, різні вуглеводи, многоатомные спирти, амінокислоти з наступним ферментативным розщепленням досліджуваних речовин й утворенням різних іонізованих продуктів розпад за своєю природою, форми і величині види мелкодисперсных носіїв (сорбентів) антигенів і антитіл, сприяють підвищенню чутливості комплексних імунологічних методів. Реакції пасивної гемагглютинации та його модифікації пов’язані з допомогою еритроцитарних діагностичних препаратів. Еритроцитарну діагностику успішно застосовуються для прискореного виявлення й ідентифікації як патогенних, і умовно патогенних мікроорганізмів (наприклад, збудників туляремії, бруцельозу, сальмонельозу та інших.) у різних патологічних матеріалах, отриманих від хворих, й у об'єктах довкілля. Реакції з эритроцитарными діагностикумами є дуже чутливими, й у такому випадку часто перевершують інші серологические реакції. Вони уведено підрозділи до офіційні інструкції по экспресс-индикации бактеріальних агентів в елементах зовнішнього середовища й в матеріалах, отримані від уражених покупців, безліч тварин. Одночасно тривають пошуки нових носіїв антигенів і антитіл, які було б безантигенными, стабільними, не разрушающимися якщо зберіганні, а застосовувані реакції - простими технічно постановки (наприклад, скляні тести) і дослідження з допомогою — економічніші. Удосконалюються реакції з застосуванням кольорових целлюлозных частинок як носіїв антигенів і антитіл.

Положительными властивостями що така препаратів є:

отсутствие власної антигенности;

стабильность якщо зберіганні;

демонстративность і простота техніки постановки реакції, зазвичай на матеріальному склі;

высокая швидкість проходження реакції;

экономичность.

Кроме того, корисним і виправданим вважаємо пошуку нових носіїв антигенів і антитіл. У такому випадку перспективними є ионообменные смоли, латексы, целюлоза і її похідні й інших речовин, що можуть сприяти підвищенню чутливості сіркологічних реакцій.

Иммунохимическое напрям, що з використанням різноманітних комплексних сполук специфічних антитіл чи антигенів з хімічними речовинами. Приєднані хімічні речовини надають їм нові феноменологічні здатності Німеччини та властивості, цим, розширюючи можливості экспресс-индикации мікробних агентів в зокрема і в лабораторного аналізу взагалі. Велику популярність і практичну значимість придбали методи швидкого иммунофлуоресцентного аналізу (прямий, непрямий, антикомплементарный), що нині офіційно використовують як методи экспрессной індикації та швидкого визначення мікроорганізмів. Подальше розвиток дуже перспективного иммунохимического напрями в що свідчить залежить від хіміків, які мають розробити досить яскраві нові барвники, котрі вступають у сполуки зі специфічними антитілами і антигенами. Через війну можна отримати препарати з новими феноменологическими властивостями, що дозволяє проводити экспресс-индикацию мікробних культур і окремих клітин з допомогою найпоширеніших мікроскопічних пристроїв (типу МБИ різних марок).

Иммуноферментное напрям, інтенсивно розвивається, а останні роки. Розроблено прямий, непрямий, антикомплементарный та інші методи швидкого виявлення мікробів шляхом застосування иммуноэнзимологического принципу; запропоновані нові види ферментів, і навіть різноманітні види хромогенных субстратів. Дане напрям є дуже перспективною, розвиток його навести найближчими роками до появи методів экспресс-индикации мікроорганізмів.

Иммуноэлектрофоретическое напрям успішно розвивається з кінця 1950;х років. Розроблено численні методи иммуноэлектрофореза. Проте задля цілей экспресс-индикации мікробів частіше вдаються до зустрічному иммуноэлектрофорезу. Застосування нових хімічних барвників, ферментної чи радіоактивної мітки дозволить різко підвищити чутливість методу иммуноэлектропреципитации.

Иммунорадиологическое напрям пов’язані з використанням різноманітних конъюгатов специфічних антитіл чи антигенів, поєднаних з радіоактивними речовинами, які дають їм нові феноменологічні властивості й уміння, р встановити природу збудника навіть у тому випадку, коли іншими методами, у вигляді його мінливості чи забруднення матеріалу, він є нерозпізнаним.

Биологическое напрям, що з вивченням токсичних і агресивних властивостей патогенних мікроорганізмів. Біологічні методи здійснюються на одноклітинних організмах, на культурах клітин, курячих ембріонах, і навіть на здорових, та ще краще спеціально підготовлених лабораторних тварин. Ці методи більш трудомісткі і менше точні проти іншими.

Физико-химическое напрям. Цей новий напрям пов’язані з використанням порівняно швидких, але до того ж час і складних по аппаратурному оформленню методів. Сюди входять методи вивчення бактеріальних популяцій та його екстрактів з допомогою хроматографії (газожидкостная та інших.), спектроскопії (інфрачервоної, ультрафіолетової та інших.), резистографии у різних антибиотических, хімічних і лікарських речовин, і навіть методи температурної і кислотною агрегації, коагуляції мікробних суспензий та його токсинів.

Рецепторное і генетичне напрями швидкої індикації патогенних і санитарно-показательных мікроорганізмів. Методи, засновані цих принципах, лише починають розвиватися. Тож з допомогою целлюлозно-глобулинового чи эритроцитарно-глобулинового діагностикумів швидко виявляють патогенний стафілокок, у якому білок А, а шляхом гомології невідомих нуклеїнових кислот з такими відомими нуклеїновими кислотами встановлюють вид патогена.

Комплексное напрям прискореної ідентифікації патогенних і санитарно-показательных мікроорганізмів, що використовує методи экспресс-индикации, засновані на інтеграції різних принципів, пов’язані з із розробкою та створенням індикаторних тест-систем, які у протягом короткого терміну і з мінімальними витратами на аналіз визначити комплекс основних ознак патогена чи санитарно-показательного представника, достатніх щодо його ідентифікації до роду, виду та навіть типу.

Направления, пов’язані із розробкою нових принципів мікробіологічного аналізу. Цілком мабуть, і ми можемо очікувати у найближчі 5−10 років появи нових ідей, підходів і принципів в мікробіологічної науці, і суміжних із нею областях. Відкриття нових видів рецепторной, імунологічної та генетичної специфічності у мікробів дозволить започаткувати нові і, можливо досконаліші методи швидкої ідентифікації мікроорганізмів.

Основные шляху розвитку экспресс-индикации мікроорганізмів на найближчими роками:

создание і конструювання нових препаратів, сприяють прискоренню і здешевленню досліджень, підвищення ефективності лабораторної діагностики інфекцій і індикації патогенних та інших мікроорганізмів. У цьому шляху необхідно зробити дуже багато, оскільки узвичаєні діагностичні препарати значною ступеня вичерпали свої потенційні можливості;

разработка нових більш чутливих, простих методів лабораторного аналізу.

разработка комплексні методи і деяких видів досліджень. Буде тривати подальша інтеграція методів і деяких видів досліджень, мають різні принципи дії, які у основі;

создание нових схем досліджень. Оскільки лабораторна діагностика інфекційних захворювань, а також экспресс-индикация, хоча у меншою мірою, пов’язані вивчення комплексу різних властивостей і особливості мікроорганізмів з допомогою зазвичай різноманітних методів і прийомів, заснованих на виключно різних принципах, то створення нових схем досліджень із застосуванням методів є об'єктивною реальністю і важливішої завданням, що з істоти самого процесу розвитку мікробіологічного аналізу;

разработка і створення методів реєстрацію ЗМІ й обліку результатів экспресс-индикационных і лабораторних досліджень.

разработка нової микроминиатюрной лабораторного посуду, апаратури і приладів для досліджень;

автоматизация і комп’ютеризація досліджень.

В сучасних умовах питання мають вирішуватися комплексно. Отже, рассмотре від 10 осіб. Флакони вміщують у термостат при 370С. Через 3 — 4 години холерні вібріони починають агглютинироваться та поступово (протягом найближчих 2 годин) падають в вигляді пластівців на дно флакона. Досліджуючи під мікроскопом забарвлені мазки і «висячу краплю », виявляють склеившихся і лише частково вільних вібріонів. Через 6 годин дається відповідь у разі виявлення холерних вібріонів негайно виробляється посів індивідуально від кожної з десяти осіб. Такий метод дає можливість досліджувати до 16 000 людина виборює 3 — 4 дня. Метод иммунодиагностической мікроплівки. Вивчення антигенних властивостей холерних вібріонів проводять шляхом постановки пробирочной чи пластинчастим реакції аглютинації з допомогою сухих лиофилизированных діагностичних агглютинирующих холерних 0-сывороток і сироваток Огава і Инаба. Сироватку розводять в фізіологічному розчині чи дистильованої води та змішують при постановці аглютинації на склі з досліджуваної культурою вібріонів. При підготовці сироватки використовується додаткова посуд, що ускладнює роботу бактеріолога, а що залишилася розлученою сироватці швидко проростає бактеріальна мікрофлора і інактивує її. Для вивчення антигенної структури холерних вібріонів були розроблений иммунодиагностический препарат як микропленок разового застосування, який мав достатньої специфічністю, демонстративностью і экономичностью. Иммунодиагностические холерні мікроплівки (ИХМП) як полімерної плівки з нанесеними висушеними краплями, фіксованими на папері, містять мінімум сироватки, пленкообразующий компонент і консервант. Пленкообразующий компонент пов’язує, склеює і фіксує микроколичества інгредієнтів до носія, виключає крошение микропленок; консервант охороняє препарат від руйнації якщо зберіганні. Концентрація діагностичної сироватки в ИХМП є достатньої, оскільки після емульгування у краплині фізрозчину, антитіла зберігають у титре 1:100, що цілком забезпечує хід реакції. Тим самим було забезпечується достатня концентрація антитіл, знижується, витрата діагностичної сироватки і виключається можливість невикористання. При цьому створюються умови до швидшого розчинення ИХМП, контакту її з холерными вибрионами і проведення реакції безпосередньо на полімерної плівці. Готові ИХМП бережуть у темному сухому місці при 4- 7 °C в картонних коробках (термін придатності 3 року — термін спостереження) і в міру потреби ИХМП уживають на означення холерних вібріонів. Щоб не допустити випадкового зараження оточуючих предметів ИХМП вміщують у чисту чашку Петрі. Поверхню ИХМП завдають краплю фізіологічного розчину, у якій розчиняють її. Розведену сироватку змішують з досліджуваної культурою вібріонів, знятої бактеріологічної петлею з живильне середовище. При іншому варіанті постановки реакції ИХМП знімають скальпелем з паперової підкладки і переносять на предметне скло, розчиняють в краплі фізіологічного розчину і змішують з досліджуваної культурою вібріонів. При позитивної реакції через 1−3 хв з’являються зерна агглютината, забарвлені до зеленої колір, а крапля просвітлюється. При негативною реакції крапля залишається гомогенно-мутной. Використану частина полімерної плівки відрізають, а решту плівки з ИХМП зберігають у тій чашці Петрі для подальших досліджень. Використання ИХМП в дослідженнях вібріонів та інших мікроорганізмів дозволяє їм отримати статистично достовірні результати, заощадити дорогі діагностичні сироватки, підвищити якість і ефективність досліджень. Реакція аглютинації микрометодом.

В останнє час у бактеріологічної практиці знайшов досить широке застосування микрообъемный метод постановки сіркологічних реакцій з допомогою спеціальних планшеток і микротитровальных голок. Реакції аглютинації микрометодом ставлять з холерными агглютинирующими референс-сыворотками в полистроловых микротитровальных планшетках із пласким чи V-образ-ным дном, виділені на иммунологическ агглютинировались в планшетках і пробірках відповідно 95 і 96% випадків. У холерних вібріонів класичного і эльтор биоваров серовара Огава співвідношення на обох методиках були самі. Цікавий факт, що з постановці реакції аглютинації з RO-сывороткой найбільше штамів, агглютинирующихся RO-сывороткой до титру, було виявлено в микрометоде; в пробірках аглютинація встановлено в однієї штами. Усі штами вібріонів 040−056 сероваров в микрометоде не агглютинировались холерными агглютинирующими сироватками, а пробірках штам II 258−1099 (040 серовара) агглютинировался усіма холерными сироватками. Більшість вивчених штамів представників сімейства Enterobacteraceae теж агглютинировалось холерными агглютинирующими сироватками, крім Sh. flexneri 2503, у що його пробірках було виявлено аглютинація з усіма сироватками, і штами P. S. typhimurium 21, яка має відзначено неспецифическая реакція аглютинації зі усіма сироватками як і пробірках, і у планшетках. При користуванні цим методом витрата агглютинирующих сироваток зменшується удесятеро, значно скорочується час, необхідне постановки реакції, і пришвидшується термін видачі відповіді. З іншого боку, описаний метод менш трудомісткий.

Таким чином, стандартність, достовірність отриманих результатів, висока економічність методу дозволяють рекомендувати його за ідентифікації холерних вібріонів, вивченні штамів і популяції штамів холерних вібріонів за ознакою агглютинабельности. До того ж: Іммобілізація вібріонів холерными сироватками і типовими холерными фагами. Краплі випорожнення чи матеріалу із поверхні пептонной води обробляють холерної О-сывороткой, типовими сироватками Огава і Инаба чи типовими холерными фагами. Готують їх препарати «роздавлена крапля », які досліджують з допомогою темнопольной і фазовоконтрастной мікроскопії. У позитивному разі через 3−5 хвилин рух вібріонів припиняється. РИФ. Препарати з досліджуваного матеріалу обробляють флюоресцирующей противохолерной сироваткою і досліджують в люмінесцентному мікроскопі.

Положительным результатом вважається виявлення в препараті навіть одиничних вібріонів з яскравим жовто-зеленим світінням як блискучого обідка по периферії клітини. Позитивний результат можна було одержати через 1−2 години від початку дослідження при концентрації вібріонів щонайменше 106 клітин на 1 мл., тому рекомендується попередньо подращивание матеріалу на поживних середовищах. Експресдіагностика туляремії Збудник туляремії (Туляре — район Каліфорнії) — Franciella tularensis належить до роду з нез’ясованим становищем в систематики мікробів. Этиологическая природа туляремії встановили 1912 року Г. Мак-коем і Ш. Чепиным, а далі докладно вивчена Э.Франсисом.

Туляремия — важка кров’яна зоонозная інфекція із природною очаговостью. Основні джерела інфекції - водяні пацюки, ондатри, зайці, пацюки, миші. Хворий людина неконтагиозен й у збудника є біологічним тупиком. Передається трансмиссивным шляхом через кліщів, а то й контактним, алиментарным чи аспирационным шляхом. Збудник містить нуклеопротеидный Проі оболочечный белково-липидный Vi-антиген. У перенесли хвороба виробляється дуже напружений і тривалий імунітет. Матеріал на дослідження: кров, гній, пунктат бубна, слиз з зіва. Реакція агглютинации-рассеивания. Запропоновано проста, швидка, високочутлива і специфічна реакція агглютинации-рассеивания, щоб поставити якої використовується антительный диагностикум. Це суспензія темно-коричневого кольору, що є комплексне з'єднання кулястих крупнодисперсных НК-частиц (Нікітін і Котич) і противотуляремийных імуноглобулінів. Препарат бережуть у холодильнику при +4°С протягом 2−3 років. Після закінчення 3 років препарат можна ресенсибилизировать, так як НК-частицы высокостабильны. Для постановки реакції агглютинации-рассеивания на старанно знежирене предметне скло завдають зліва ставляться також Y. pseudotuberculosis і Y. enterocolitica, викликають септичні гастроэнтероколиты чи иерсиниозы.

Чума — особливо небезпечна, дуже складна кров’яна інфекція, схильна до широкої поширенню і дає великий відсоток смертності (від 20 до 100%). Це зоонозная трансмиссивная природно-очаговая інфекція. Джерела — пацюки, ховрахи, піщанки, полівки, бабаки, мишоподібні гризуни. Переносники — кровососущие комахи. У складі бактерій чуми міститься більше півтора десятка специфічних і групових антигенів. Переболевшие набувають довічний, стійкий імунітет фагоцитарного характеру. Матеріал на дослідження: вміст бубонов, отделяемое виразок, мокроту, кров, випорожнення. Метод паперових індикаторних систем. Класичні методи (посів на середовища Гисса) громіздкі, вимагають багато часу й великої кількості поживних середовищ, котрі мають обмежений термін придатності. Нині ці методи не задовольняють запитам протичумної системи. Нині найперспективніших методом визначення ферментативної активності штамів збудника чуми з єдиною метою ідентифікації виділених культур і вивчення їх властивостей вважатимуться метод углеводно-бумажных дисків, запропонований В. М. Никитиным і С. В. Плугару. Як середовища краще використовувати бульйон Хоттингера, т.к. він надає найбільш швидку ферментацію — 3 години. Доцільно застосовувати БІС в польових умовах, оскільки набори компактні і може тривалий час зберігатися при кімнатної температурі. Фаготипирование. 1. Внесення бактериофага в досліджуваний матеріал в останній момент його посіву на агар з генцианвиолетом дає змоги виявити під мікроскопом негативні колонії фага чи «доріжку «у години, коли зростання бактерій ще майже помітний (через 2,5 — 3 години). Метод простий, доступний і дає хороші результати при високої концентрації чумного мікроба і за щодо великому змісті сторонніх мікроорганізмів. 2. Визначення наростання титру чумного фага, внесеного в досліджуваний матеріал, де у в разі наявності збудника фаг починає розмножуватися вже 30−40 хвилин. У рідкий досліджуваний матеріал (25−50−100 мл) й у контрольну рідина додають стільки фага, щоб одержати його підтримку розведення 1:50 — 1:100; ставлять проби в термостатах при 370C на 45−60 хвилин. Після інкубації беруть 0,5 мл рідини з кожної проби і розводять бульйоном удесятеро раз; від цього першого розведення фага готують серію послідовних 10-кратных розведень (до 10−10 — 10−11). По 0,5 мл рідини з кожного розведення досліджуваного і контрольного рядів додають до 2,5 мл напіврідкого агару (0,1%), попередньо розплавленого і далі охолодженого до 48−500С. Відразу до агару додають 0,1 — 0,2 мл суспензії 1 — 2 добової індикаторної культури (вакцинный штам чумного мікроба), у якому 15−20 млрд мікробів один мл. Вміст пробірок старанно перемішують і виливають на чашки Петрі з 2% агаром Хоттингера. Потому, як напіврідкий агар застигне, чашки перевертають дном догори і ставлять у термостат при 370С. Облік результатів виробляють через 3−4 години. З огляду на суцільного зростання індикаторної культури видно стерильні плями (негативні колонії фага), кількість яких чашках з досліджуваним матеріалом може перевершувати в 100−1000 і більше разів число негативних колоній на контрольних чашках. Завдяки хорошою дифузії фаговых частинок і бактеріальних клітин через напіврідкий агар двухслойный метод дає стерильні плями більшого розміру, аніж за размазывании досліджуваної маси шпателем по поверхні агару. Підрахунок колоній ведуть у лічильної камері. До того ж: РИФ, РПГА і ін.

Некоторые інші методи

Хемилюминесцентный иммуноанализ. Новим етапом по дорозі розвитку імунологічних методів діагностики ООИ є хемилюминесцентный иммуноанализ — ХЛИА. Перевага цього визначається її високої чутливістю, відносної простотою і продуктивністю, можливістю повної автоматизації У відкритої літературі є окремі повідомлення, присвячені застосуванню ХЛИА в медичної мікробіології, як виявлення бактеріальних антигенів, і Специфічність ХЛИА залежить від якості використаних імуноглобулінів. На 42 близькоспоріднених і гетероло-гичных штами позитивні реакції було з Y. pseu-doTuberculosis 81 6111(37°) з чумними загальними ВПК і У. sereus 1 і трьох з сибірковими ВПК в концентраціях 1 -106 м. т./мл. ХЛИА слід рекомендувати для лабораторної діагностики ООИ особливо у випадках, як у досліджуваному матеріалі передбачається незначне зміст збудника.

Иммуноблотинг

Иммуноблоттинг — різновид гетерогенного імунного аналізу. Сутність його в перенесення молекул досліджуваного речовини з однієї твердого носія, використовуваного для фракционирования біополімерів, в інший, де з допомогою імуннохімічної реакції відбувається їх специфічне виявлення. Залежно від досліджуваного речовини розрізняють ДНК, — РНК і білок — блоттинг. При постановці иммуноблоттинга дотримується наступна методична послідовність: электрофоретическое поділ аналізованого матеріалу на індивідуальні білки чи поліпептиди в гелі; отримання репліки шляхом блоттинга білків чи полипептидов з гелю на твердофазный матрикс; блокування фону, відмивання від компонентів, використовуваних при блокуванні фону; инкубирование зі специфічною тест-сывороткой; відмивання від життя сироватки; инкубирование з Jg до антитіл специфічної тест-сыворотки, конъюгированными з міткою; відмивання від життя міченого иммунореагента; виявлення тестируемых антигенів авторадиографически чи ферментативно за реакцією з певним субстратом. Иммунохимическое виявлення антигенів робити з допомогою антитіл, конъюгированных з міткою. Як мітки останнім часом широко застосовують або радіоактивні ізотопи, або ферменти (пероксидазу, лужну фосфатазу, лактамазу та інших.). Час блоттинга шляхом дифузії становить 36−48 год. Але найбільше швидке й ефективний засіб перенесення білків з гелів — электроблот, час якого, в основному, становить 1−3 год (2), декому високомолекулярних білківбільш 12 год. Конкретний вибір сорбентів щодо різноманітних модифікацій блотов (нитроцеллюлоза або папір, оброблена відповідним чином), вибір умов блокування і иммуно-химического виявлення антигенів цілком залежить від антигену, його кількості, методу иммуноанализа і цілей дослідження. Метод ВБ за цілою низкою обставин отримав найбільшого поширення як засіб, придатний використання газу як тесту підтвердження. Безумовна гідність методу — можливість тестування антитіл до слабко чи взагалі нерастворимым антигенів й неможливість стадії запровадження радіоактивної мітки в антигени. Про чутливості у разі ВБ судять по граничного кількості завданого на гель антигену, яке за фракционировании білків вдається виявити иммунохимически після перенесення з гелю на тверду фазу (нитроцеллюлозу). Загальна чутливість аналізу залежить цілої низки причин: умов фракционирования і іммобілізації антигену на твердому носії, рівня фону, специфічності і аффинности антитіл. Важливе значення має тут вид використовуваної мітки та їх виявлення.

Таким чином, метод иммуноблотинга дозволяє ідентифікувати зони антигену на твердої фазі, не пов’язуючи весь білок з антитілами специфічної сироватки. Иммуноблотинг і його модифікації переважно йдуть на типування бактеріальних і вірусних антигенів і антитіл, особливо тоді недостатньою роздільної здатності звичайних систем, і навіть під час аналізу імуноглобулінів, нуклеїнових кислот чи як тест підтвердження разом із іншими методами.

Обнаружение збудників, антигенів і антитіл з допомогою суспензионных препаратів.

Принцип: фіксовані на частинках компоненти входять у реакцію антиген-антитіло, що супроводжується освітою великих, видимих неозброєним оком агломератов. У суспензионных препаратах щоб виявити і кількісного визначення антигенів і антитіл використовується властивість багатьох неорганічних і органічних речовин, як-от активоване вугілля, дерматол, бентоніт, каолін, гидроокись алюмінію, сі технічних можливостей лабораторії, контингентом заражених людей, характером і масштабом поширення гаданої інфекції. Діагностику необхідно провести у найбільш короткі терміни, тому що від цього залежить ефективність ізоляції і лікування хворих. При працювати з патологічним матеріалом важливо враховуватиме й попереджати можливість зараження медичного персоналу, тому треба суворо дотримуватися інструкції по збору матеріалу від хворих. Класичні методи експрес-діагностики в здебільшого вичерпали себе, у зв’язку з цим необхідно розробляти принципово нові, такі як ПЛР та інших. і автоматизувати існуючі.

Таким чином, експресдіагностика ООИ і з сьогодні залишається актуальною й однією з найважливіших завдань мікробіології і епідеміології. Список використаної літератури Прискорені методи діагностики інфекційних захворювань (рб. тр.) -Кишинів, «ШТИИНЦА », 1987. Препарати для експрес-діагностики (рб. тр.) — Ленінград, 1981. Иммунохимия і лабораторна діагностика особливо небезпечних інфекцій (рб. тр.) — Саратов, 1985. Щербак Ю. Ф. Особливо небезпечні інфекції - М., «Медицина », 1975. Рання і диференційна діагностика основних інфекційних захворювань (уч.-мет. посібник) — Ленинград, 1988. Медицина катастроф (уч. посібник) — М., «ІНІ Лтд », 1996. Лебедєва М. Н. Керівництво до практичним занять із медичної мікробіології - М., «Медицина », 1973. Борисов Л. Б., Козьмин-Соколов Б.М., Фрейдлін І.С. Керівництво до лабораторним занять з медичного мікробіології, вірусології і імунології - М., «Медицина », 1993. Повлович С. А. Медична мікробіологія в графах — Мінськ, «Вышэйшая школа », 1986.