Вплив гіпотермії на культивовані клітини

У культурі клітин можна змоделювати дію температурних параметрів, які відповідають умовам гіпотермії, що спостерігають у людей та тварин. Дію легкої (35,5 °С) та помірної (34 °С) гіпотермії досліджували на культивованих впродовж 14−16 діб остеобластах, виділених зі склепіння черепа новонароджених щурів, а також остеокластах, одержаних у культурі з моноцитів/макрофагів кісткового мозку мишей 6−8-тижневого віку [28]. Виявлено пригнічення проліферації та диференціації остеобластів за вказаних режимів гіпотермії. Кількість остеобластів у культурі після 14 діб культивування в умовах помірної гіпотермії (34 °С) зменшилась на 30%. Крім того, знизився біосинтез лужної фосфатази, остеокальцину та колагену I типу. Формування кісткових вузликів остеобластами, культивованими при 34 °C упродовж 16 діб зменшилось на 95%, а при 35,5 °С — на 75% порівняно з контрольною культурою (37 °С).

Встановлено, що під впливом гіпотермії (32 °С) у культурі фібробластів порушується мітотичний цикл через подовження фази G1 [34]. J. Patel і співавт. [27] вважають, що іншим механізмом пригнічення проліферативної активності остеобластів може бути порушення функції рецепторів TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) каналів, бо саме остеобласти експресують різні рецептори цих каналів (TRPV2 та TRPV4). Можливо, що TRPV-канали є температурними сенсорами клітин [42], проте це припущення потребує подальшого вивчення.

У культурі остеобластів людини (лінії NHOst) досліджували дію короткочасної (впродовж 12 год) легкої (35 °С) та тяжкої (27 °С) гіпотермії [23]. Доведено, що після впливу легкої гіпотермії остеобласти залишалися життєздатними та біосинтетично активними, однак у них підвищувалася інтенсивність флуоресценції актинових волокон цитоскелета, які беруть участь у руховій активності клітин та клітинних органел.

Після впливу на культивовані остеобласти тяжкої гіпотермії відмічено вираженіші (порівняно з дією легкої гіпотермії) зміни в структурі цитоскелета. Актинові волокна з інтенсивною флуоресценцією локалізувалися навколо ядра, а в нормі вони розташовані рівномірно в цитоплазмі та виявляють незначну флуоресценцію. Змін у тубулінових структурах (мікротрубочки) практично не виявлено. Крім того, спостерігали зниження активності лужної фосфатази та остекальцину, а також експресії CD44 (поверхневого клітинного глікопротеїну, який відіграє важливу роль в адгезії та міграції клітин). Встановлено, що збільшення терміну дії легкої гіпотермії до 24 год призводило до появи апоптотичних клітин, кількість яких була на 3,54% більшою, ніж у контрольній культурі, проте остеобласти залишалися метаболічно активними [32]. В умовах тяжкої гіпотермії кількість апоптотичних клітин збільшилась на 13,2%, зафіксовано зниження на 56,7% біосинтезу остеобластами білків. Збільшення часу культивування остеобластів до 5 діб в умовах тяжкої гіпотермії (27 °С) призводило до значного зниження експресії мРНК, яка кодує матриксний білок SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine). Він відіграє важливу роль у формуванні позаклітинного матриксу, а також у регуляції проліферації, адгезії та руховій активності остеобластів, що є важливою ланкою остеогенезу. За його участю відбувається збалансування процесів формування кістки та її резорбції [43]. Під дією гіпотермії відмічено зниження експресії SPARC та проліферації клітин.

У випадку культивування впродовж 16 діб мононуклеарних попередників остеокластів на дисках зі слонової кістки з додаванням факторів, які стимулюють остеокластогенез, M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) і RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), встановлено значне збільшення кількості остеокластів у культурах після дії легкої (35,5 °С) і особливо помірної (34 °С) гіпотермії порівняно з контрольною культурою (37 °С) [28]. Збільшувалась також площа резорбції дисків, на яких культивували мононуклеарні попередники остеокластів, що свідчить про диференціацію та активацію остеокластів. Кількість остеокластів і лакун резорбції підвищувалась у 1,5 раза (при 35,5 °С) і у 2 рази (при 34 °С) порівняно з контрольною культурою. На думку авторів, результати, одержані в культурі клітин, дають змогу припустити негативний вплив гіпотермії на ремоделювання кістки в літніх людей через активацію процесу резорбції.

На відміну від наведених даних щодо активізації в умовах гіпотермії остеокластогенезу S. Meghji та співавт. [44] встановили, що в разі культивування остеобластів (клітинна лінія остеобластів МО 63) упродовж доби (температура 33 °С) підвищувався біосинтез остеопротегірину, а експресія рецепторів RANKL залишалася на тому ж рівні, тобто створювалися умови для пригнічення активації остеобластів.

Відомі дослідження щодо впливу індукованої гіпотермії (легкої - до 32 °C, помірної - до 28 °C та тяжкої - до 20 °C за класифікацією Н. Є. Міщук [28], J. Marx [26]) на культивовані хрящові клітини, а саме: на фенотип хондроцитів, їх диференціацію, метаболізм та формування позаклітинного матриксу.

Зокрема, A. Ito і співавт. [45] під час вивчення метаболічних показників культивованих хондроцитів свині у культурах (21 доба) з різною температурою (32, 37 і 41 °С) встановили вірогідне зниження показників вмісту колагену типу IIA1, сульфатованих глікозаміногліканів, мРНК та ДНК у культурах з температурою 32 °C порівняно з 37 °C. Значне пригнічення синтезу глікозаміногліканів та ДНК спостерігали в культурах з температурою 41 °C.

В іншому дослідженні проаналізований структурно-функціональній стан хондроцитів суглобового хряща свині, які культивували впродовж 8 діб з різною температурою (32 і 37 °С). Зафіксовані достовірно нижчі показники проліферації хондроцитів у культурах з температурою 32 °C порівняно з 37 °C, а кількість апоптотичних клітин була вірогідно вищою в культурах з нижчою температурою. Синтез MMP13 (матриксної металопротеїнази) та II типу колагену також був вірогідно нижчим у культурах з температурою 32 °C.

A. Ito зі співав. [47] вивчали вплив температур 32, 37 та 41 °C на культуру хондроцитів суглобового хряща людини високої щільності, яку вирощували впродовж 21 доби. Диференціацію хрящових клітин, формування позаклітинного матриксу оцінювали за показниками матричної рибонуклеїнової кислоти (мРНК) за допомогою гістологічного та гістохімічного аналізів. Встановлено, що показники, які характеризують диференціювання хрящових клітин, мРНК — експресію колагену IIA1 типу і хрящового олігомерного матриксного білка були найвищими в культурі при 37 °C, а найнижчі - при 32 °C. У результаті гістологічного та біохімічного аналізу виявлено, що синтез колагену II типу та протеогліканів значно знижувався при 41 °C. Під час культивування хондроцитів людини впродовж трьох діб встановлено достовірно вищий загальний рівень РНК у культурах, які культивували при 37 °C порівняно з 32 °C. Показники вмісту гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) та цитрат-синтетази (CS), які беруть участь у гліколізі та циклі лимонної кислоти, були значно нижчими у культурах з температурою 32 °C [48].

Метаболізм культивованих хондроцитів хряща свині досліджували в культурах (3 доби) при 24, 32 та 37 °C [49]. Найнижчі показники вмісту РНК, лактату та протеогліканів спостерігали в культурах з температурою 24 °C, а найвищі - з 37 °C. Автори зробили висновок про негативний вплив гіпотермічних температур на метаболізм хондроцитів.

Отже, результати досліджень in vitro свідчать про негативний вплив індукованої гіпотермії різної інтенсивності на структурно-метаболічні показники культивованих клітин — як остеобластів та остеокластів, так і хондроцитів.

Розглянемо, як гіпотермія діє на стан клітин (проліферативну активність, ультраструктурну організацію, особливості метаболізму) та структурну організацію матриксу кісткової та хрящової тканин на рівні організму.