Отримання моноклональних антитіл

року міністерство освіти Російської Федерации.

Самарський Державний Университет.

Реферат на тему:

ОТРИМАННЯ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТЕЛ.

Виконала студентка 542 Б групи біологічного факультету СамГУ.

Миронова Ирина.

Самара.

2001 Введение.

Багатьом досліджень, що з вивченням біологічних структур великою цінністю представляють реагенти, здатних специфічно взаємодіяти з цією структурою. Універсальним реагентом, які мають зазначеним властивістю, вважається молекула імуноглобуліну. Попри те що, що імуноглобуліни, будучи антитілами, взаємодіють тільки з антигеном, тобто із молекулою здатної викликати імунна відповідь, для більшості структур вдається підібрати умови, за яких вони стають антигенами і індукують вироблення компліментарних антитіл (наприклад, при кон’югації з сильними иммуногенами). Саме цим пояснюється велике поширення імунологічних методів, що з використанням антитіл, у різноманітних галузях біології і медицины.

Серйозну проблему при застосуванні антисывороток для ідентифікації і кількісного визначення антигенів у різноманітних галузях досліджень представляє неспецифічне зв’язування та перехресна реактивність антител.

История створення метода.

Чимало дослідників намагалися знайти засоби одержання антитіл з вузької специфічністю. Так, за певних умов імунізації бактеріальними полісахариди вдасться одержати высокогомогенный апарат антитіл із вузькою специфічністю. З іншого боку, можливо злиття плазмацитомы (пухлини, посталої з антителообразующей клітини чи його попередника) з клітинами селезінки імунізованого тваринного, отримавши в такий спосіб гібридні клітини (гібридоми), що успадкували від пухлинних клітин здатність необмежено розмножуватися, як від клітин селезінки — синтезувати антитіла визначеною специфичности.

Передумовами до виникнення методу отримання гібридом, синтезують моноклональні антитіла, були розробки двох методологічних подходов:

1) отримання миелом, адаптація їх до місцевих умов культивування поза организма;

2) метод соматичної гібридизації клеток.

У мишей досить легко отримати миеломы (плазмацитомы). Ці пухлини є однієї клітини (тобто мають моноклональное походження) і секретують унікальні імуноглобуліни, що з яких можуть взаємодіяти з такими відомими антигенами. Пухлини індукують у тварин шляхом внутрибрюшинного запровадження мінеральних масел чи інертного твердого пластика. Для виникнення миелом велике значення має тут генетичний статус тваринного, і тільки в двох ліній инбредных мишей експериментаторам удалося одержати такі пухлини. Миеломные клітини миші виявилися надзвичайно зручними з вивчення біохімії продукції імуноглобулінів і дали дуже багато розуміння структури, механізмів секреції та його функції. Проте, мієломна система як джерело антитіл до більшості антигенів не виправдала надії дослідників — не вдавалося імунізувати тварин, та був отримати мишачі миеломы, продукують антитіла до иммунизирующие антигену. З тисяч миеломных пухлин, индуцированных у мишей, лише окремі виробляли імуноглобуліни, які реагували з такими відомими антигенами, було виявлено шляхом грубого скринирования з безліччю потенційних антигенів. Отже, миеломные білки виявлялися з невідомої антигенної специфічністю. Інший передумовою виникнення методу отримання гібридом стала техніка гібридизації соматичних клітин, розробка яких широко проводилася після відкриття феномена спонтанної гібридизації. При злитті плазматичних мембран клітин утворюються клітини з цими двома чи великою кількістю ядер — гетерокарионы. Після першого розподілу ядра зливаються й утворюється одне ядро з набором хромосом від усіх котрі злилися партнерів — утворюється гібридна клітина. Низьку частоту освіти гібридів можна було збільшити, використавши ряд агентів, викликають злиття: вірус Сендай, лизолецитин, полиэтиленгликоль. Навіть якби використанні агентів, що підвищують злиття, частота які виникають гібридів вкрай низька. Для їх виділення необхідні селективні середовища, дозволяють зростати переважно утвореними гібридам. У цей час розроблено кілька принципів селекції гібридних клітин. Однією з найпоширеніших є метод, заснований на застосуванні системи, що містить гипоксантин, амидоптерин і тимидин (система ГАТ). Селекція гібридних клітин полягає в тому, що у ГАТ середовищі батьківські миеломные клітини гинуть, а нормальні клітини селезінки що немає здатністю зростати при умовах культивування, отже виживають і розмножуються лише гібридні клітини, що успадкували від батьківських клітин здатність розмножуватися і синтезувати специфічні иммуноглобулины.

Подготовительные етапи перед проведенням слияния Полностью процедура отримання моноклональних антитіл включає у собі такі етапи: імунізація тварин; підготовка клітин злитися; злиття; відбір индуцирующих специфічні антитіла клонів; клонування і реклонирование; масова напрацювання гибридомных клітин; отримання культуральної рідини чи асциту, містять антитіла; виділення антитіл. Зазвичай вся процедура від початку імунізації до виділення антитіл займає 3−4 місяці. Організація праці та устаткування. Робота одержання гібридом бажано виділити окреме приміщення. Експеримент можна й в частини великий кімнати, максимально віддаленій від вхідних дверях. Це приміщення треба оснастити наступним устаткуванням: Ламинарный бокс із вертикальною чи горизонтальній подачею стерильного повітря. Стерильність забезпечується наявністю фільтрів, затримуючих частки крупніша 0,3 мкм. Інкубатор, у якому автоматично підтримується вологість, температура і концентрація СО2. Низкоскоростная центрифуга з підвісними склянками, бажано з охолодженням. Звичайний і инвертированный мікроскопи з фазово-констрастным пристроєм. Холодильник на +4 і -200 З. Водяний лазня на +37 і +560 З. До того ж в окремому приміщенні бажано мати морозильник на -700 З повагою та посудину Дьюара з рідким азотом для зберігання клітин. Для отримання гібридом потрібно придбати також спеціальну пластикову посуд для культури клітин: 96-луночные планшети із пласким дном, 24-луночные планшети, флакони з площею зростання 25, 75 см² та інших., пластикову посуд щодо імуноферментного і радиоиммунологического аналізів, середовища для культивування, необхідні реактиви, сироватку плоду корови (СПК). Приготування окремих компонентів середовищ для культивування. Основними середовищами, уживаними щоб одержати гібридом, є середовище RPMI 1640 і середовище Голка в модифікації Дульбекко. Застосовуються та інші середовища, в частковості, середовище Дульбекко в модифікації Иксова. Середовища випускаються як готових розчинів, 10-кратных концентратів і сухих порошків. Найкращі результати виходять при приготуванні середовищ за умов лабораторії з сухих порошків, але важливе значення має якість води. Для приготування середовищ необхідна деионизированная і двічі перегнанная в кварцової посуді вода. Вибір експериментального тваринного. Зазвичай для імунізації використовують мишей і пацюків. Це з тим, що підходящі миеломные клітини мишей і пацюків поширені та, крім цього, технічно нескладне складнощів вирощування отриманих гібридом в організмі цих тварин. Інші тваринах практично ніхто не використовуються. При імунізації тварин імунна відповідь виробляється попри всі антигенні детермінанти всіх компонентів який вводимо матеріалу. Це значно ускладнює відбір клонів, які продукують антитіла до цікавій для антигенної детерминанте, бо їх частка може бути незначною. Тож за змогу імунізації застосовують очищені антигени, по крайнього заходу під час останніх етапах імунізації. Однією з основних достоїнств гибридомной техніки і є саме те обставина, що специфічні антитіла проти даного антигену можна отримати роботу, узявши для імунізації неочищений препарат антигену, і вживаючи слова які згодом ці антитіла очищення антигену. Способи імунізації. Призначення процесу імунізації у тому, щоб дозволяють збільшити частку клітин, які продукують антитіла заданої специфічності, і перевести ці клітини в функціональне стан, у якому вони можуть зливатися і утворювати антителообразующие гібридні клітини. Експериментально встановлено, що з гібридизації необхідні виділяти селезеночные клітини тварин через 3−4 діб після останнього запровадження антигену, тобто тоді, як у лимфоидных органах багато активно пролиферирующих клітин. Конкретна схема імунізації залежить від природи антигену та її імуногенності. Антигени клітинної поверхні є сильними иммуногенами, тоді як «більшість розчинних білків — слабкі иммуногены. У разі необхідно застосовувати різні адъюванты, які посилюють імунна відповідь. Серед адъювантов найбільшого поширення отримав повний ад’ювантний Фрейнда (ПАФ). До того ж, використовують запровадження антигену, преципитированного на квасцах, та введення разом із антигеном убитих клітин Bordetella Pertussis. Зазвичай антиген вводять неодноразово, що необхідно у розвиток сильного імунної системи, хоча надмірна імунізація може мати протилежний ефект — зазначено, іноді у клітин гипериммунизированных тварин знижується здатність утворювати гібридоми. У окремих випадках буває достатньо та однієї імунізації. Під час імунізації необхідно визначати титр антитіл до антигену (титр антитіл — величина, зворотна розведенню сироватки, коли він ступінь імунологічної реакції знижується вдвічі проти максимальної). Зазвичай роблять перед останньої иммунизацией. У досвід набирають тварин із високим титром антитіл. Не можна очікувати хороших результатів гібридизації, якщо імунізації тварин немає освіти антитіл або їх утворюються у низькому титре. Більшість розчинних антигенів можна використовувати таку схему імунізації. Впроваджують 1−100 мкг антигену в ПАФ або у вигляді преципитата на квасцах внутрибрюшинно. Якщо є можливість, то одночасно вводять 2*109 убитих клітин B. Pertussis. Через 2−3 тижня вводять антиген на фізіологічному розчині внутрибрюшинно чи внутрішньовенно. Цю процедуру можна повторювати до появи високого титру антитіл. Останню імунізацію роблять внутрішньовенно, через 3 діб тварини забиваються, і готується суспензія клітин для гібридизації. При застосуванні як иммуногена різних клітин (пухлинні клітини, чужорідні клітини крові, бактерії, паразити тощо.) роблять кілька ін'єкцій без адъюванта внутрибрюшинно з інтервалом в 2−3 тижня по (1- 5)*107 клітин. Останню ін'єкцію роблять внутрішньовенно і крізь 3 дня виділяють клітини селезінки для гібридизації. Останнім часом активно розвиваються методи повної імунізації поза організму для одержання гібридоми. Імунізація in vitro має низку істотних переваг: вкорочується період імунізації до 4−5 діб; потрібно істотно менше антигену; до багатьох антигенів можна було одержати більш виражений імунна відповідь (частково з допомогою зниження вкладу толерантності і супрессии); підвищується відсоток відповідальних клітин; легко перевіряти чинники, що впливають ефективність імунізації. Сучасні методи імунізації in vitro засновані двома системах культивування лімфоцитів, розроблених наприкінці 60-х років. Метод суспензионного культивування був охарактеризований першим методом, у якому імунізація повністю проходила поза організмом. Критичними чинниками у цьому методі були низька концентрація кисню у атмосфері (7%), висока щільність клітин, легке погойдування культури, щоденне додавання свіжої середовища проживання і вибір підходящої партії СПК антигену (використовували еритроцити барана). Іншим основним системою імунізації in vitro є метод Д. Марбрука. Клітини культивують у маленькому камері на діалізної мембрані, якою йде обмін середовищем із великої резервуара. Однією з основних недоліків імунізації in vitro є частка IgMїхнім виокремленням клонів. Це з тим, що з імунізації in vivo клітини беруть під час вторинного імунної системи, у якому утворюються у основному антитіла IgG класу, тоді як in vitro реакція йде з первинному типом якого характерна продукція IgM антитіл. Проблема може бути подолана після відпрацювання способів отримання вторинного імунного відповіді in vitro.

Слияние Существуют дві основні варіанта додавання ПЕГ, які у справжнє час. Перший методу ось у чому. Протягом 1 хв додають 1 мл 50% розчину ПЕГ при 370 із постійним перемішуванням. Потім розчин поступово розбавляють до 10 мл протягом декількох хвилин середовищем без сироватки, після чого клітини центрифугируют і ресуспендируют серед культивування. У другому методі використовують тривалішу обробку клітин розчином ПЕГ. До осадку клітин додається 30−35% ПЕГ при кімнатної температурі. Клітини центрифугируют 2 хв, потім їх одягнули залишають при кімнатної температурі поки що не 5−7 хв. Потім їх розводять у великому обсязі середовища з сироваткою, обмивають і культивируют.

Клонирование гибридомных клеток Клонирование здійснюється виділення стабільних клонів гибридомных клітин. Для недавно освічених гибридомных клітин характерні висока нестабільність, що з втратою хромосом. При культивуванні можуть з’являтися клітини, втративши здатність продукувати антитіла і вони можуть переростати антителообразующие гібридні клітини. До основним методам клонування клітин ставляться клонування методом лимитирующих розведень, клонування в полужидком агарі і клонування з допомогою приладу — проточного цитофлуориметра. Клонування методом лимитирующих розведень. Якщо клітини посіяно в 96- луночные планшети дуже рідко, частка лунок, у якій простежується зростання клітин, підпорядковується розподілу Пуассона: [pic] де f (0) — фракція лунок, у яких відсутня зростання; (- середня кількість клітин на лунку. При (= 1 f (0) = 0,37. А, щоб отримати розумну ймовірність лише одну клона в лунці, на більш 37% лунок на повинен спостерігатися зростання клітин. Оскільки ефективність клонування рідко буває рівної 100%, клітини необхідно засівати при щільності 10, 3 і 0,5 клітин на лунку. У групі тих планшетах, у яких простежується зростання о пів лунок, містяться ізольовані клони. За першого клонуванні активної може бути лише дещиця клонів. Необхідно завжди виробляти повторне клонування, у якому частка позитивних клонів зростатиме. Для клонування треба застосовувати клітини яке живить шару. Використовуються самі види клітин, що у початкового зростання гібридом. Клонування в полужидком агар-агаре. Для клонування гібридом можна застосовувати напіврідкий агар. Зазвичай береться система, що складається з двох верств. Нижній (твердий) шар містить 0,5% агар-агару серед культивування. Йому дають затвердіти. Потім додають другий — м’який, у якому 0,3% агарагару, куди включаються клоновані клітини. З використанням клітин яке живить шару їх засівають в чашку Петрі до заливання агар-агару, і реальне середовище культивування видаляють безпосередньо перед додаванням нижнього шару агару. Колонії стають видимими через 7−14 діб, їх переносять на рідку культуру. Клонування з допомогою проточного цитофлуориметра. Приготавливают флуоресцентні микрошарики з латексу і покривають їх антигеном. Такі кульки адсорбуються на антигенспецифических гибридомных клітинах, що дозволяє виділяти їх у цьому приладі. Після виділення тим чи іншим способом позитивних клонів, клітини цих клонів розмножують достатньої необмеженій кількості й зразки їх замораживаются.

Массовая напрацювання моноклональних антител После відбору гибридомных клітин, синтезують цікаві для дослідника антитіла, можна розпочати їх масовому нарощуванню для одержання великих кількостей моноклональних антитіл. На початку культивування гибридомные клітини можуть рости повільно й погано переносити низьку щільність посіву. У зв’язку з цим при пересеве клітин їх треба розводити лише в 3−5 раз. Прискоренню зростання клітин може призвести до додавання клітин яке живить шару. Гибридомные клітини необхідно підтримувати в логарифмічною фазі розвитку і уникати підвищення концентрації клітин вище 0,5 млн/мл. Клітини можна культивувати як і стаціонарної культурі, і в роллерной, соціальній та різноманітних культиваторах (ферментерах). Для отримання максимальної продукції моноклональних антитіл клітинам дозволяють зростати до граничною щільності. У такій культурі через певний час спостерігається загибель гибридомных клітин. Надосадочная рідина збирається, а клітинний осад відкидається, тобто прагнуть культивувати далі решта живі клітини. Для отримання великих кількостей антитіл вводять гибридомные живі клітини в організм тварин і звинувачують одержують від них асцитную рідина. Попередньо тваринам вводять агенти, що б здатність гібридом зростати в черевної порожнини. Як такого агента найчастіше виступає пристан — 0,5 мл за 10−14 діб до запровадження клеток.

Очистка антител Для багатьох цілей непотрібен очищення антитіл, і їх використовують як культуральних рідин чи асцитных рідин. Грубу иммуноглобулиновую фракцію можна було одержати высаливанием білків сульфатом амонію з наступним діалізом. Якщо антитіла необхідно виділити в чистому вигляді, то попередньо визначають їхнього класу і підклас, оскільки способи очищення різняться для антитіл різних класів. Це можна зробити з допомогою методу иммунодиффузии по Ухтерлони. Виділення чистих антитіл найкраще проводитися иммуносорбентах. У цьому методі, проте, є загроза, що з фіксації змінюється антигенная структура клітинної поверхні. Якщо вдасться виділити антитіла прямим способом, то отримують иммуноглобулиновую фракцію з допомогою різних методів аффинной і ионообменной хроматографії на сефарозес пришитим ковалентно білком А.

Заключение

Одна із завдань клітинної інженерії полягає у створенні клітинних систем з новими властивостями з урахуванням клітинних взаємодій. Нині вдосконалюються методи імунізації поза організмом і вивчаються механізми активації В-лимфоцитов. Особливо важливо щоб одержати моноклональних антитіл людини. Однією з умов подальших успіхів по дорозі отримання клітин та клітинних систем з новими властивостями є поглиблення знань, що стосуються фундаментальних основ біології: механізмів регуляції процесу клітинної диференціації, фізіології протопластів як об'єкта біологічної трансформації клітин, взаємовідносин клітинних органел. Отже, прогрес у розвитку клітинної інженерії буде зацікавлений у значною мірою визначатися успіхами у сфері клітинної біології і серпоподібною клітинною физиологии.