Вміст глутамінової кислоти у камерній волозі

Содержание глутаминовой кислоти у камерному волозі в хворих первинної открытоугольной глаукомой.

Glutamic acid concentration in aqueous humor of open angle glaucoma patients.

By many authors glutamate renders neurotoxic effect on retinal ganglion cells. It is possible that glutamic acid concentration increase in eye tissues with primary open angle glaucoma (POAG) plays an important role in optic nerve glaucoma atrophy pathogenesis.

Aqueous humor of 10 patients with POAG were taken during cataract extraction and examined. The quantities of glutamic acid were determined by chromatographic method.

Glutamic acid concentration in aqueous humor of control group was 28.6±1.6 mkg/ml and in group with POAG — 84.9±28.7 mkg/ml. The difference wasn’t statistically reliable. Thus there is a tendency to glutamic acid concentration increase in eyes with POAG.

Результаты досліджень останніх років істотно вплинули на ставлення до патогенезі глаукоматозной атрофії зорового нерва — глаукоматозной оптичної нейропатію.

Было встановлено, що характерним проявом глаукоматозной оптичної нейропатію є апоптоз — загибель ганглиозных клітин сітківки. Quigley [6] вважає, що ушкоджений, можливо, внаслідок високого ВГД, аксон ганглиозной клітини сітківки несе достатньої інформації, що зумовлює активації механізмів природною загибелі клітини. Можливо, ці процеси активізуються недостатністю кровотоку у судинах очі при підвищеному ВГД. Було показано, що з цим є значне збільшення змісту глутаминовой кислоти (глутамата) в стекловидном тілі хворих первинної открытоугольной глаукомою (ПОУГ). Глутамат є основним нейромедиатором ЦНС і сітківки. У той самий час підвищення концентрації глутамата вище фізіологічного рівня викликає у сітківці блокаду межнейрональной передачі нервових імпульсів і узгоджується з селективним апоптозом ганглиозных клітин сітківки из-за нейротоксического дії глутамата [5]. Brooks D.E. et al. [7] знайшли у собачих очах із експериментально викликаної глаукомою підвищений вміст витреального глутамата, триптофану і низький вміст глицина проти контролем. На думку авторів, висока концентрація глутамата токсична для гангліїв сітківки і доводить ішемічний механізм порушень, які у клітинах сітківки.

Сама ідея про нейротоксическом дії глутамата на нервову тканину, зокрема, на ганглиозные клітини сітківки, запозичена з неврологічної практики. Неврологи близько 20 років надають значення великим концентрациям даного трансмиттера у розвитку такий патології, як хвороба Альцгеймера, розсіяний склероз, деменція, амиотрофический бічний склероз та інші [4]. Підвищений вміст глутамата в стекловидном тілі хворих глаукомою, загибель ганглиозных клітин сітківки у його впливом в дослідах на пацюках дозволили E.B. Dreyer і співавт. [6] припустити, що це механізм їх загибелі має місце і за ПОУГ. Проте причина внутрішньоклітинного випуску глутамата в повному обсязі зрозуміла. E.B. Dreyer і співавт. [6] вважають, що, можливо, високе внутріочне тиск призводить до виходу глутамата у внутрішньоклітинні простору, призводячи до загибелі клітин, який токсичний для ганглиозных клітин. Другий імовірною причиною загибелі клітин, на думку авторів, є збій в ферментних системах, відповідальних за руйнація даного нейромедиатора після виходу його з синапсів. Складність для підтвердження цих поглядів у тому, що дуже важко перевірити дані факти на «живому» оку, проте безсумнівно, що великі концентрації гутамата токсичні для нервової тканини.

Учитывая вищесказане, метою нашого дослідження було виявлення глутамата в хворих ПОУГ.

Материалы й ефективні методи дослідження.

Опытную групу склали 10 хворих ПОУГ (6 чоловіків, 4 жінки, середній вік — 74 року), які мають забиралася камерна волога під час экстракапсулярной екстракції катаракти з антиглаукоматозным компонентом. 8 хворих був із розвиненою стадією ПОУГ, 2 з далекозашедшей. Контрольну групу склали хворі зі старческой катарактою — 14 пацієнтів (11 чоловіків, 3 жінки, середній вік — 68 років). Основна і контрольна групи були можна порівняти за віком й супутнім соматичним захворювань.

В основу методу покладено описані Боде і Гирі методи кількісного визначення амінокислот як мідних похідних з нингидридином після хроматографічного їх поділу на папері з нашого модифікації [1].

1. Підготовка проби для аналізу. Пробы камерної рідини обсягом 0,1−0,2 мл зважують на аналітичних терезах, упаривают насухо на водяній бані при 40 °C в скляних микрочашках, використовуючи плаваючий штатив. Сухий залишок розчиняють в 0,05 мл дистильованої води.

2. Одержання одномірних хроматограмм камерної рідини глаза. 20 мкл отриманих розчинів порціями по 5 мкл з допомогою автоматичної піпетки завдають на хроматографическую папір марки «швидка» розміром 2×27 див. Хроматографирование проводять спадним методом двічі на одному напрямку спочатку у суміші розчинників I, потім другого десь у суміші II. Суміш I: н-бутиловый спирт, крижана оцтової кислоти, дистильована вода (4: 1: 5). Суміш II: н-бутиловый спирт, крижана оцтової кислоти, дистильована вода (40: 15: 5). Після кожного пропускання розчинника папір висушують надворі і знову вміщують у хроматографическую камеру. Час проходження розчинника щодо одного напрямі 7 годин. Висушений хроматограмму занурюють сталася на кілька секунд в 0,5% розчин нингидрина в ацетоні, просушують протягом декількох хвилин надворі і підігрівають 10 хвилин, у сушильній шафі при 50 °C у розвиток забарвлення. Плями амінокислот стають чіткішими через добу, тому визначення кількісного змісту амінокислот слід проводитися наступного дня.

3. Кількісне визначення глутаминовой кислоти у камерному рідини глаза. Фіолетові плями, відповідні глутаминовой кислоті, вирізають, розрізають на дрібні осколки і вміщують у микропробирки, містять 0,25 мл спиртового розчину сульфату міді. Фіолетова забарвлення перетворюється на оранжево-красную внаслідок освіти мідного похідного амінокислот з нингидрином. Екстракцію продовжують у протягом однієї години при кімнатної температурі. Інтенсивність забарвлення вимірюють на фотоэлектроколориметре Humalyzer 2000 при довжині хвилі 505 нм в микрокюветах проти контрольної проби на папір. Розрахунки за змістом амінокислоти проводять за каліброваному графіку, одержаному зі стандартними розчинами глутаминовой кислоти.

4. Побудова калибровочного графіка. Готовят розчини глутаминовой кислоти 0,001 М, 0,75 М, 0,0005 М, 0,375 М, 0,25 М. На папір завдають по 20 мкл розчинів. Розрахунок роблять за формулі:

А = (З x 5×10−2)/V

А — концентрація глутаминовой кислоти у камерному волозі (мкг/мл); З — зміст глутаминовой кислоти, знайденою по каліброваному графіку (мкг/мл); V — обсяг проб (мл).

Результаты дослідження та обговорення.

Содержание глутамата камерної вологи у контрольній групі становило 28,6±1,6 мкг/мл, при ПОУГ — 84,9±28,7 мкг/мл (різниця статистично недостовірна, p>0,05).

Хотя нами і отримано статистично достовірних відмінностей у змісті глутамата в хворих ПОУГ й віковий катарактою, проте є явна тенденція до вищої концентрації даного нейромедиатора у камерному волозі хворих ПОУГ. У 5 з десяти хворих ПОУГ зміст глутамата в камерної волозі було значно вища, ніж у контрольній групі і коливалося не більше від 37,6 мкг/мл до 260,3 мкг/мл.

У хворих старческой катарактою найвища концентрація глутаминовой кислоти становила всього 33 мкг/мл.

Участие деяких нейромедиаторов в регуляції офтальмотонуса показано на роботах А. В. Мягкова [2,3], який довів вплив опиоидных пептидів для підвищення ВГД, впливаючи електричними коливаннями і хімічними подразниками на мигдалевидний комплекс. Через війну отриманих даних не можна погодитися з гіпотезою посилення апоптозу ганглиозных клітин сітківки при ПОУГ внаслідок накопичення у яких глутаминовой кислоти. Проте дана гіпотеза вимагає вивчення.

Проведенные дослідження вперше дозволили знайти глутаминовую кислоту у камерному волозі в хворих ПОУГ. Зміст глутамата в хворих ПОУГ вище, ніж у контрольній групі.

1. Медичні лабораторні технологій і діагностика: Медичні лабораторні технології. Довідник у два томах / Під ред. А.М. Карпищенко// Микрометод визначення вільних амінокислот в сироватці крові з допомогою хроматографії на папері. Т.2. — С-Петербург, «Интермедика», 1999. — З. 106−109.

2. Мягков А. У. Вплив пунктурных впливів на офтальмогипертензию, викликану електричної та хімічної стимуляцією мигдалеподібного комплексу: Авореф. дисс. на соиск. учений. степ. канд. мед. наук. — Казань, 1997 — 21 з.

3. Мягков А. В. Участь опиоидных пептидів у центральній регуляції внутріочного тиску і гідродинаміці очі // Тез. Доповідей 7съезда офтальмологів Росії. — М., 2000.- С.175−176.

4. Пляхин І.В. Біохімічні основи пролонгируемой клітинної смерті. // Міжрегіональний збірник научн. Трудов / Біохімія межі ХХІ сторіччя. — 2000.- Рязань. — С.173−177.