Використання ретровірусних векторів

Результативним способом перенесення ДНК в ембріональні лінії тварин є застосування ретровірусних векторів.

Ретровіруси — сімейство еукаріотичних вірусів, генетичний матеріал яких представлений одноланцюжковою РНК.

Віруси складаються покритих липопротеїдною оболонкою вірусних частинок діаметром 70−120 нм і внутрішньої капсули ікосаедричної форми, яка містить дві копії геномної РНК довжиною 5−10 тисяч пар нуклеотидів у формі рибонуклеопротеїни. Зовнішня оболонка вірусу є частиною цитоплазматичної мембрани клітини господаря і представлена короткими гликопротеїдами. Ендогенні ретровіруси є хромосомними елементами і складають до 1% ДНК в геномі людини [Tarusio Mantovani, 1998]. Ендогенні ретровіруси є одним з різновидів ретроелементов, що складають до 10% геному ссавців.

За своїй здатності інфікувати клітини господаря ретровіруси поділяються на екотропні і амфотропні. Екотропние віруси здатні реплиціюроваться в клітинах тільки одного або декількох близько споріднених видів тварин. Так, наприклад, вірус лейкемії миші (MLV) розмножується тільки в клітинах миші та щури. Амфотропние віруси, навпаки, мають широкий спектр господарів і здатні до розмноження в клітинах різних видів ссавців.

Геном всіх здатних до реплікації ретровірусів влаштований аналогічним чином і складається з трьох кодують регіонів, які, не дивлячись на те, що мова йде про послідовності РНК, отримали назву генів. Ген gag кодує білки капсиду і вірусного кора. Ген кодує pol вірусну реверсивну транскриптазу й інші пов’язані з вірусом нуклеази. Ген кодує env глікопротеїди у вірусній ліпідної оболонці.

Геноми РНК ретровірусів містять на своїх кінцях повторюваних послідовностей, які залежно від типу вірусу мають довжину від 10 до 80 нуклеотидів. Вони отримали назву R-сегментів. На 3-кінці геномної РНК R-сегмента розташований регіон U3 довжиною 170−1250 нуклеотидів, а на 5 'кінці r-сегмента регіон u5 довжиною 80−100 нуклеотидів. При формуванні ДНК-копії вірусного РНК-геному на кінцях молекули відбуваються зміни: на 5 'кінці розташовується сегмент U3, а на 5' - U5. Такіе характерні для ДНК-форми ретровірусоа ділянки отримали назву LTR — довгих кінцевих повторів. LTR, розташований на 5 'кінці несе дуже сильний промотер, тоді як LTR на 3' кінці містить сигнали Поліаденілювання РНК.

Інфекція починається з взаємодії ретровірусу з клітинною мембраною і зв’язування поверхневого білка ретровірусу (env) зі специфічним білком-рецептором. Проникнення ретровірусу в клітину відбувається за допомогою мікропіноцітоза. В одних вірусів кор, що складається з білка gag, РНК-залежної ДНК-полімерази (реверсивної транскриптази), інтегрази і двох копій ретровірусної РНК, переноситься в ядро, де і відбувається транскрипція, а в інших вірусів транскрипція здійснюється безпосередньо в цитоплазмі. Зворотня транскрипція вірусної РНК в двухцепочечну ДНК здійснюється за допомогою ферменту реверсивної транскриптази, що є частиною комплексу ферментів кора. У ході транскрипції відбувається дуплікація послідовностей на 5 'і 3' кінцях ретровірусу. Якщо транскрипція має місце в цитоплазмі клітини, то дволанцюжкова ДНК вірусу транспортується в ядро, де відбувається її циркуляція з подальшою інтеграцією однієї або декількох копій в геном клітини. Така інтегрована ДНК клітини хазяїна форма існування вірусного геному отримала назву провірусу. Кроки життєвого циклу ретровірусів.

Для інтеграції необхідна наявність на обох кінцях ДНК 9 пар підстав, які пізнаються і відщеплюються закодованої у вірусі специфічної інтегрази, що є частиною комплексу ферментів кора. Процесу інтеграції завжди передує відщеплення двох пар основ на обох кінцях провірусу і подвоєння 3−6 пар основ (залежно від типу вірусу) послідовності ДНК клітини хазяїна. Хоча інтеграція в геном клітини господаря не є специфічною, слід відзначити, що місця інтеграції часто розташовуються в транскрипційно активних ділянках ДНК. Якщо відбувається інтеграція в геном генеративних клітин, то ретровіруси передаються у спадок нащадкам. У цьому випадку мова ведуть про ендогенних ретровірусів.

Інтегрована вірусна ДНК транскрибується з допомогою РНК-полімерази клітини-хазяїна та трансляцірується як і інші клітинні гени.

Утворені в ході процесу транскрипції продукти є ідентичними вірусної РНК. Всі транскрипти містять на 5 кінці кеп-сайт, а на 3 кінці ділянку Поліаденілювання. Такі РНК служать матеріалом для синтезу білків капсиду і вірусного кора, а також білків зворотної транскриптази. Ці білки утворюють з геномної РНК вірусу комлекс-кори, після чого вірусні частинки залишають клітину через цитоплазматичну мембрану. При цьому кор бере з собою частину мембрани клітини господаря, з якої утворює оболонку. Інтеграція вірусних частинок в геном клітини господаря відбувається тільки в мітотично активні клітини.

Інфікування клітин ретровірусами найчастіше за все не позначається на їхній життєдіяльності. Однак якщо інтеграція провірусу сталася поблизу клітинних протоонкогенів, то можлива їх активація і, як наслідок, загибель клітин. Порушення життєздатності клітин. Може мати місце і в тому випадку інтегріраціі провірусу в діючий клітинний ген (наприклад, пухлинні гени-супресори).

Найбільш часто використовуваними ретровірусними векторами являються вектори на основі ретровірусів миші типу С (вірус лейкемії миші) Такі векторні системи складаються з двох компонентів: векторної конструкції та лінії клітин-пакувальниці.

У векторної конструкції (провірусної ДНК) гени, кодіруюрущіе структурні білки ретровірусу (gag, pol, env), замішані іншими важливими генами (генами в-галактозидази і стійкості до неоміцину). Джерелом структурних білків є клітинна лінія, яка містить інтегрований у геном провірус.

Даний провірус модифікують таким чином, що у нього відсутній сигнал впізнавання ш, необхідний для упаковки вірусної РНК. Таким чином, транскрипційного вірусна РНК не може бути упакована у вірусні частинки.

РНК векторної конструкції, навпаки, містить сигнал впізнавання ш і тому може бути упакована в рибонуклеопротеїдними комплекс. Таким чином, відбувається формування інфекційних вірусних частинок, що містять інформацію ретровирусного вектора і переносять її в інфіковані клітини. Однак такі вірусні частки не здатні до утворення нових вірусів, тому що в інфіцируємої клітинної лінії відсутня генетична інформація про структурні білках, необхідних для формування вірусних частинок.

Необхідними складовими частинами векторної конструкції є 5 'і 3' LTR, а так само сигнал упаковки, розташований «вниз за течією» від 5 'UTR. Експресія трансгена направляється промоторів 5 'UTR або альтернативними вірусними або клітинними промотерамі (наприклад, вірус саркоми Рауса, тирозин, б-казеїн). Вперше присутність вірусної ДНК в клітинах дорослих мишей встановлено в 1974 році. Ретровірусних вектори можуть служити альтернативою для ефективного транспорту генів у сільськогосподарських тварин. Інфекція зигот або імплантаційних ембріонів у більшості випадків призводить до отримання трансгенних тварин-мозаїки. Поясненням цьому служити те, що інтеграція відбувається тільки в тому випадку, якщо клітина вступає в мітоз після попередньої реплікації ДНК. Усі нащадки, які народилися з інфікованих ооцитів, були трансгенними (табл.1). Не дивлячись на обмежене число отриманих трансгенних тварин, були доведені передача трансгена у спадок і експресія рекомбінантного продукту.

Ефективність отримання трансгенного ВРХ з використанням ретровірусної інфекції ооцитів у метафазі II другий мейотичного поділу.

Перевагою використання ретровірусних векторів для отримання трансгенних тварин є те, що до 100% оброблених ембріонів можуть бути успішно інфіковані ретровірусами.

Недоліком застосування ретровірусних векторів є їх обмежена ємність (розмір вставки не повинен перевищувати 8 000 п. н. Крім того, в результаті сплайсингу з ретровірусів вирізаються інтронні послідовності, які як і інші дистальні або проксимальні послідовності грають важливу роль в ефективній експресії генів у трансгенних тварин [Palmiter et ai, 1991]. До недоліків лікування ретровірусними векторів слід так само віднести придушення експресії трансгенів in vivo внаслідок інактивації вірусних промоторів в клітинах, наприклад, за допомогою а-і у-інтерферонів, що діють на вірусні LTR [Ghazizadeh et ai, 1997]. Однак дана проблема може бути вирішена за допомогою включення в ретровірусну конструкцію внутрішніх промоторів або використанням нового покоління ретровірусів, що містять модифіковані ділянки контролю експресії, такі як внутрішній рибосомних сайт (IRES) [Salen, 1997] і тетрациклінова регуляторна система [lida et ai, 1996].

Ще одним обмеженням використання ретровірусних векторів для отримання трансгенних тварин є їх низький титр. Звичайні ретровірусних вектори мають титр 1×105−6 колонієутворюючих одиниць (cfu) у мл [Kim et ai, 1993; Archer et ai, 1994]. Низький титр ретровірусів обмежує способи їх введення в ембріони. Проблема низького титру була нещодавно вирішена за допомогою розробки нового вектора на основі вірусу везикулярного стоматиту (псевдотіп VSV-G) [Burns et ai, Yee et ai, 1994]. Відомо, що тропізм ретровірусу визначається геном env, тому його заміна у векторі на ген env іншого ретровірусу може розширити спектр господарів і змінити властивості ретровірусу. Дана технологія отримала назву псевдотіпірованія. Включення білка вірусу везикулярного стоматиту С у вектор на основі Мо — MLV (Burns et al, 1994) дозволило зробити його більш стабільним при ультрацентрифугування. Цей вектор може бути сконцентрований до титру 1×109−10 КУО / мл і має дуже широкий спектор клітин-господарів. З його використанням були отримані трансгенні лінії клітин комах, ссавців, амфібій, риб, а також створені трансгенні тварини. Високий титр ретровірусу зробив можливим отримання трансгенних тварин за допомогою ін'єкції містить віруси середовища в перівітеліновий простір [Chan et al, 1998) / У ооцитах великої рогатої худоби обсяг перівітелінового простору становить 200−300 ПКЛ. При використанні вірусу з титром 1 * 10 9−10 КУО / мл, ін'єкція 10 ПКЛ призводить до проникнення в перівітеліальний простір від 10 до 100 інфекційних вірусних частинок. Якщо титр вірусу дорівнює 1 * 105−6 КУО / мл, то для введення в ембріон однієї вірусної частинки знадобилося не менше 1 нл розчину.

До недоліків використання ретровірусів належить можливість клітинних онкогенів за допомогою вірусних транскрипційних послідовностей. Навіть при застосуванні ретровірусів, які не можуть існувати як інфекційні вірусні частинки, існує хоча й дуже невеликої, але ризик, що при рекомбінації з присутніми в ембріонах ендогенними ретровірусними послідовностями можуть утворюватися нові активні форми ретровірусів.

Не дивлячись на перераховані недоліки та обмеження, ретровіруси можуть бути широко використані для трансгенеза у тваринництві. Успішне введення генетичного матеріалу в ооцити робить можливим проведення генної терапії спадкових захворювань. Використання ретровірусних векторів дозволяє здійснювати трансформацію окремих органів. Так, Archer з співавторами [1994] ввели в молочну залозу кози шляхом інфузії через сосковий канал в період гормонально індукованого маммогенеза ретровірус, який кодує гормон росту людини (hGH). Лактація настала на 14-ий день гормональної обробки. Максимальний рівень hGH (60 нг / мл) спостерігався в перший день лактації і потім опускався до 12 нг / мл на 9−12 дні лактації.

Аналогічні експерименти з використанням експресійна вектора pLNS, отриманого на основі Mo-MLV проводяться у відділі біотехнології Всеросійського НДІ тваринництва.

LTR — довгий кінцевий повтор, ш + - сигнал упаковки, Н4 — промотер гистона людини, NEO — ген стійкості до неоміцину, ЕР — делеція в області промотера-енхансера, РА — сигнал Поліаденілювання Цей вектор містить тільки цис-діючі послідовності генома вірусу, необхідні для реплікації. Послідовності вірусу, що кодують білки, виключені з векторної конструкції. Вектор містить 5 'довгий кінцевий повтор LTR, з якого відбувається транскрипція, ш + область, відповідальну за упаковку вірусного генома в віріон, ген стійкості до неоміцину, під контролем промотера Н4 гістона людини для селективного введення конструкції в клітинну лінію і 3' LTR з делецій в області промотера-енхансера вірусу. Після одного циклу реплікації делеція в області ЕР LTR буде присутнім на обох кінцях провірусу, регуляторні елементи провірусу будуть повністю інактивованих і клоновані гени будуть експресуватися тільки під контролем власних промотеров.

Доведено можливість успішної інфекції альвеолярних клітин молочної залози свиней і корів рекомбінантними ретровірусами.

Інфекція молочної залози не носить локального характеру. Послідовності провірусу крім досвідчених долей вимені були виявлені в контрольних частках молочної залози, в слинної залозі, селезінці, підшлунковій залозі, спинному мозку, надниркових. ІФА молока свиней виявив наявність рекобінантного продукту в кількості від 30 до 290 нг / мл.

Основними недоліками методу безпосередньої інфекції окремих органів тварин є необхідність використання великої дози ретровірусів з тим, щоб інфікувати достатнє число клітин, а так само неможливість передачі трансгена в спадщину наступному поколінню тварин. Однак на відміну від введення грансгенів в ембріональні лінії, даний підхід дозволить синтезувати рекомбінантні продукти в молоко вже через кілька місяців після початку експерименту. Для ВРХ у порівнянні з традиційним методом мікроін'єкції витрати часу від початку експерименту і до отримання перших результатів про рівень експресії в молоці скорочуються, відповідно, з 4−5 років до 4 5 місяців.