В самому кінці XVI віку Луцьк починає ві догравати значну ролю в українському церковно му житті. В тих часах у Луцьку було ще чотири манастирі св. Василія й Пречистенський в місті, Черчецький біля села Черчець і Спаський на Крас ному та біля 15 церков, як св. Анастасія, Воскре сення, Вознесення на Яровиці, св. Михайла, св. Івана—катедральна в замку, Покровська.Пятииць ка, Рождественська, св. Духа, св. Симеона і Троїць ка. Луцька православна єпископія була дуже ба гата, бо володіла 4 місточками, 2 замками й 34 селами. Серед луцьких владик, що мали титул єпископів луцьких і острозьких та екзархів усієї Руси, найбільш відомий Кирило Терлецький, один з ініціяторів церковної унії з Римом. Цей владика ще відомий тим, що провадив завзяту боротьбу з ченцями Жидичинського манастиря, найбільшого тоді на Волині.

З моментом народження унії починається сильна католицька акція на Волині. В 1604 році прибувають до Луцька єзуїти, що її спровадив сюди луцький біскуп Шишковський, й згодом закладають тут свої школи, при яких навіть відбувалися вищі курси науки. В 1614 році єзуїти для конкуренції з Братською школою заложили українську школу. Одначе та школа серед українців 5ула дуже непопулярна й її мусили з браку учнів зліквідувати.

Оживлення релігійного життя, як наслідок тодішніх церковних і політичних подій, не оминуло також православних українців у Луцьку. Вже в 1600 році чуємо про існування тут якогось православного братства. В 1617 році це братство остаточно зорганізувалося. Першим ктитором Луцького братства був ігумен черчецького манастиря Герасим Микулич, а основоположниками його були місцева українська цпяхта, місцеве духовенство і міщіне. З перших членів братства найбільше відомі: Лаврентій Древинський—чашник Волинський, Михайло Гулевич—Воютинський— підсудок Луцький, Хведір Святополк кн. Четвертинський, Юрій кн. Пузина, о. Іван Гораїнович Черчецький, ієромонах Ісаакій Борискович, о. Іван Федорович, ієромонах Паїсій Мостицький та інші. Членами його були також славетні особи, як митро полит Київський Петро Могила, гетьман Іван Виговський, Марина Мазепина—гетьманова мати. Кон-стянтин Вовк—запорозький полковник. В 1619 році король Жигимонт III дає братству грамоту, на підставі якої братство будує церкву з шпиталем і притулком, В 1620 році єрусалимський патриарх Теофан дав братству грамоту з правом ставропігії, що звільняло цю організацію зпід єпископської юрисдикції. В 1623 р. константинопільський патриарх Кирило Лука рис підтверджує цю грамоту й благословляє братство. Користаючи в таких привилеїв, воно розвиває широку діяльність. При братстві крім шпиталя й притулка існує також школа, статут якої був взірцем для інших братських шкіл на Україні.

В цій школі вчили граматики, реторики, дія-лєктики, аритметики; з предметів церковних були: читання, церковний спів, святе письмо й наука про святих. Той, хто бажав вступити до братської ніколи, мусів за 3 дні запізнатися з усіма її порядками й дати до шкільної каси 4 гроша. Статут братської школи порушував багато справ, а його приписи спричинилися до того, що ця школа за більш як 100 літ свого існування, завдяки взірцевому порядкові й високо поставленій науці, дала українському суспільству багато осіб, що відограли в його житті важну ролю. Крім того братство мало свою друкарню, що часово була також при черчецькому манастирі. В 1628 році в братській друкарні іероманах Павло Маткович видрукував книжки для Служби Божої, які тепер є бібліографічною рідкістю.

Католики, яким братство було луже немиле, часто гальмували працю цієї організації. Нераз ченці братського манастиря Й самі братчики скаржаться до гродського суду, що різні особи нападають на них і на церкву та "чинять насилія і безчинства". Особливо рік 1634 записався в історії братства кривавою подією. 24 травня на Боже Тіло учні місцевої єзуїтської колегії напали на манастир цього братства, побили й покілічили палками та камінням ченців, вчителів, учнів, що вчилися в братській школі; не пожаліли й калік, що жили в притулку, в церкві вони знищили дорогі килими, а з церковної каси забрали біля 150 зол.

Після смерти короля Жигимонта III в 1632 р. 13 червня на соймику в Луцьку біля 200 осіб української волинської шляхти гостро виступили в обороні прав православної церкви. Новий король Владислав IV того ж року видав "статті замирення", на підставі яких відновлювалася православна єпископська катедра в Луцьку, що від 1595 року перебувала в руках уніятських владик. Рік опісля висвячено на луцького православного єпископа Афанасія Пузину, що зайняв Луцьку катедру щойно по смерти уніятського владики Почаповського в 1636 році. Єпископ Пузина являється одним з найбільших оборонців православної віри, за ініціятивою якого щороку зїзджалося до Луцька православне духовенство з цілої Волині на синоди, що звичайно відбувалися 9 жовтня в день Івана Богослова (храмове свято луцької катедри). Опис такого зїзду був видрукований 1638 року в Кремянці під заголовком: „Синод ведлєзвичаю доречного"...